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1、第二章 基因工程的載體和工具酶,第一節(jié) 載 體,載體必須是復(fù)制子。,基因克隆的目的是使目的基因在特定的條件下得到擴(kuò)增和表達(dá)，而目的基因本身無(wú)法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)、不易進(jìn)入受體細(xì)胞、不能穩(wěn)定維持，所以就必須借助于“載體”及其“寄主細(xì)胞”來(lái)實(shí)現(xiàn),作為基因克隆的載體必須具備以下特性,具有合適的篩選標(biāo)記，便于重組子的篩選。,具備多克隆位點(diǎn)（MCS），便于外源基因插入。,自身分子量較小，拷貝數(shù)高。,在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高。,（一）質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性（二）質(zhì)粒載體的制備 （三）質(zhì)粒載體的改造（四）幾個(gè)常用質(zhì)粒載體,一 質(zhì)粒載體（plasimid vectors）,（1）質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的裸露

2、的雙鏈環(huán)狀(少數(shù)為線形和RNA） DNA分子。,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（2）質(zhì)粒的大小差異很大，最小的只有1kb,只能編碼中等大 小的2-3種蛋白質(zhì)分子，最大的達(dá)到200kb。,（3）質(zhì)粒的生存在寄主細(xì)胞中“友好”地“借居”，離開了寄主 它本身無(wú)法復(fù)制；同時(shí)質(zhì)粒往往有宿主專一性，如大腸 桿菌的復(fù)制起點(diǎn)不一定能在其它生物細(xì)胞中繁殖。,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（4）質(zhì)粒的復(fù)制類型,（5）質(zhì)粒的不親和性,根據(jù)拷貝數(shù)將質(zhì)粒分為兩種復(fù)制型：,“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒（stigent plasmid），拷貝數(shù)為1-3；“松弛型”質(zhì)粒（relaxed plasmid），拷貝數(shù)為10-60。,

3、不過(guò)即使是同一質(zhì)粒，其拷貝數(shù)在不同的寄主細(xì)胞間和不同的生長(zhǎng)環(huán)境也可能有很大的變化。,兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。載體質(zhì)粒與受體的質(zhì)粒應(yīng)是不同的不親和群。,一種質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中存在的數(shù)目稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。,接合型質(zhì)粒分子量大嚴(yán)緊型復(fù)制,非接合型質(zhì)粒分子量小松弛型復(fù)制,是否含有接合轉(zhuǎn)移基因,非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，不含tra基因；可以為轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒所帶動(dòng)轉(zhuǎn)移。,轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒，含有tra基因；能通過(guò)結(jié)合作用從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。,在一般情況下，質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移能力與分子大小及復(fù)制型間有一定的相關(guān)性?，F(xiàn)歸納如下：,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性, 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移,（7）質(zhì)粒的存在形式有超螺旋、

4、開環(huán)雙螺旋和線狀雙螺旋三種,（一）質(zhì)粒的生物學(xué)特性,（二）質(zhì)粒DNA的制備,目前一般使用堿變性法制備質(zhì)粒DNA。這個(gè)方法主要包括培養(yǎng)收集細(xì)菌菌體，裂解細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開及除去蛋白質(zhì)和RNA。,分離質(zhì)粒的方法有多種，如堿裂解法、煮沸裂解法、層析柱過(guò)濾法等。,堿變性法質(zhì)粒提取的原理,通過(guò)冷卻或恢復(fù)中性pH值使之復(fù)性，線性染色體形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而cccDNA可以準(zhǔn)確迅速?gòu)?fù)性，通過(guò)離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質(zhì)粒DNA。,在pH值12.012.5范圍內(nèi)時(shí)，線性的DNA會(huì)被變性而共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA卻不會(huì)被變性。,堿裂解法提取質(zhì)粒,1 挑取LB

5、固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于3.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37、250rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約16-17hr）。,2 取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心12000rpm，1min， 棄上清,3 將細(xì)菌沉淀重懸于100l預(yù)冷的溶液中，重懸，使菌體分 散混勻,4 加200l新鮮配制的溶液，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺?蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液 為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）,5 加入150l預(yù)冷的溶液，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色 絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。,加入450l的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4離心 12000g 10

6、min,7 小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的 無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4離心12000g15min,8 1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4離心8000g10min， 棄上清，將沉淀在室溫下晾干,9 沉淀溶于20l TE（含RNase A 20g/ml），37水浴 30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆谩?溶液 I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA，pH 8.0,Tris-HCl控制溶液的pH,葡萄糖使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部，因此如果缺了葡萄糖幾乎沒(méi)有影響；,EDTA螯合是Ca2+和Mg

7、2+等二價(jià)金屬離子，高達(dá)10 mM 的EDTA就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉，抑制DNase的活性，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，如果不加EDTA也不用怕DNA會(huì)迅速被降解,溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS,用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用；新鮮的0.4 N的NaOH是保證NaOH溶液沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性，因?yàn)槠屏鸭?xì)胞的主要是堿，而不是SDS；,這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會(huì)斷裂，基因組DNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩,在pH值介

8、于12.0 -12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋變性。共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，緊密地結(jié)合在一起,溶液III,3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸（pH4.8）,加入后就會(huì)有大量的沉淀，是因?yàn)镾DS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀；高濃度的鹽(3 M醋酸鉀) ，使得沉淀更完全；溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn),2M的醋酸是為了中和NaOH，調(diào)pH值至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因而復(fù)性迅速

9、而準(zhǔn)確；而線性染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈因彼此已完全分開，復(fù)性緩慢且錯(cuò)誤率高，纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了；,盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合，由于染色體DNA太長(zhǎng)且纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大腸桿菌的基因組DNA也同時(shí)被共沉淀,另外長(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，基因組DNA一旦發(fā)生斷裂成50100 kb大小的片斷，就不會(huì)被PDS共沉淀；所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入,25/24/1的苯酚/氯仿/異戊醇,苯酚用來(lái)變性蛋白質(zhì),但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如

10、4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收,酚與水有很大的互溶性，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)）；用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時(shí)就會(huì)被除干凈,異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收,2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇,與含有質(zhì)粒的水相混勻，室溫放置2-5min，4離心12000g15min,水相含有足夠多的鹽，只要2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀,如果放到20，時(shí)間一長(zhǎng)反而會(huì)導(dǎo)致大量鹽的沉淀,如

11、果感覺(jué)發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個(gè)小時(shí)以上，或者4離心8000g7min，并用tip將沉淀打碎,TE緩沖液含RNase（50 ug/ml）,37水浴30min以降解RNA分子，-20保存?zhèn)溆?，不然大量未降解的RNA會(huì)干擾電泳結(jié)果,堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）如果不小心在溶液II加入后過(guò)度振蕩，會(huì)有第四條帶，這條帶泳動(dòng)得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷有時(shí)候抽提到的質(zhì)粒會(huì)有710條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺

12、旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致,瓊脂糖電泳鑒定質(zhì)粒DNA,顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度快超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快線性DNA分子的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比,改造或增加基因表達(dá)的調(diào)控序列。,（三）質(zhì)粒載體的改造,去掉不必要的DNA區(qū)段。,減少限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，一種酶只保留一個(gè)。（單一的 限制性酶切位點(diǎn)）。,加入易于撿出的選擇性標(biāo)記基因。,對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行安全性改造，要求質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移。,（四）幾個(gè)常用質(zhì)粒載體,1. 質(zhì)粒pBR322,pBR3224363,（1）氨芐青霉素抗性基因（ampr或Apr）含3種限制酶 單一識(shí)別位點(diǎn)

13、。（2）四環(huán)素抗性基因（tetr或Tcr）內(nèi)部有7種，啟動(dòng)區(qū)內(nèi)有2種限制酶單一識(shí)別位點(diǎn) 。（3）DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）,結(jié)構(gòu)特點(diǎn),pBR3224363,（4）對(duì)多種常見的限制性內(nèi)切 核酸酶只含有一個(gè)能切割的 位點(diǎn),BR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（1）具有較小的分子量。 4363bp，2.6106Da,（2）具有兩種抗菌素抗性基因可 供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào),（3）具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng) 過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增之后,每個(gè)細(xì) 胞中可累積10003000個(gè) 拷貝,外源DNA,pBR3224363,PstI酶切,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,連接酶,重組子(ampstetr) 空載體(amprtetr) 插入子(

14、ampstets),野生型的E.coli (ampstets),導(dǎo)入,涂布在含Tc的平板上,重組子轉(zhuǎn)化子(ampstetr) 空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),影印在含Ap的平板上,空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),對(duì)比兩個(gè)平板上的菌落，凡在Tc平板上生長(zhǎng)而在Ap平板上不能生長(zhǎng)的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽(yáng)性克隆，分離出重組質(zhì)粒。,2. pUC質(zhì)粒載體,1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的,結(jié)構(gòu)特點(diǎn),（4）MCS區(qū)段:是一段用于插入外源DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成，而且每個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在整個(gè)載體中是

15、唯一的。,（1）來(lái)自于pBR322的Ori,（2）氨芐青霉素的抗性基因（ampr)。 但核苷酸序列發(fā)生了變化,（3） LacZ基因 ：編碼半乳 糖酶的肽鏈即氨基末端。,2. pUC質(zhì)粒載體,與pBR322相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：,（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù),如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500700個(gè)拷貝,（2）適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體,通過(guò)-互補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子,（3）具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS）,可以定向克隆防止載體自我連接,-互補(bǔ) (alpha-complementation),大腸桿菌

16、-半乳糖苷酶 可以和其底物X-Gal 相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的-片段和-片段分開時(shí)就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶-片段的LacZ 基因插入到載體的多克隆位點(diǎn)的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的片段。這樣一來(lái)，含有功能性完整的LacZ 基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時(shí)，載體編碼的 -片段就能和寄主編碼的片段發(fā)生互補(bǔ)并具有了對(duì)底物X-gal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是 alpha-complementation.,X-Gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別，如果 LacZ插入外源基因被破壞，菌落則是無(wú)色的 。,X-Gal,-半乳糖苷酶,IPTG誘導(dǎo)物,異丙基-D-硫代半乳糖苷,半乳糖,5-溴-4-氯-靛藍(lán),檢測(cè)重組體,第二節(jié) 基因操作的工具酶,一 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用二 DNA連接酶及其應(yīng)用三 DNA聚合酶及其應(yīng)用四 修飾性工具酶,（一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)（二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類（三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名（四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性（