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1、第一節(jié) 液相色譜儀器（high performance liquid chromatograph）,液相色譜儀（1）,液相色譜儀（2）,液相色譜儀（3）,液相色譜儀（4）,Agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng),二、高效液相色譜法的特點 （feature of HPLC）,特點：高壓、高效、高速、高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試 樣的高效分離分析方法。,高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法,經(jīng)典液相柱色譜裝置,高效液相色譜儀,例：分離20種氨基酸,柱長：170 cm柱徑：0.9 cmF：30 mL/ht分離: 20 h,經(jīng)典柱色譜,HPLC,t分離：1 h,慢中等快,色譜分離,液相色譜以液體為流動

2、相，固定相可以是固體或液體（擔載在固體表面），與氣相色譜比，帶來一系列變化：例如，填充柱氣相色譜柱，一般填料的尺寸為80-100目，粒度大約是2毫米，而一般高效液相色譜的固定相粒度在210微米，因此流動相通過這樣一段固定床時就產生了很高的反壓。,由于液體與氣體性質的以下差異：溶質在液體中的擴散系數(shù)比它在氣體中小105倍左右液體粘度比氣體約大102倍液體表面張力比氣體大104倍左右液體密度比氣體約大103倍液體不可壓縮,因此，我們通常所說的高效液相色譜，實際也是高壓液相色譜，因為沒有很高的壓力就不可能產生很高的分離效率。,三、流程及主要部件 （process and main assembly

3、of HPLC）,1.流程（動畫）,2. 主要部件,(1) 高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m）， 液體的流動相高速通過時，將產生很高的壓力，因此高 壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調、耐腐蝕等特性。,(2)梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,(3) 進樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其

4、結構如圖所示：,(4) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,(5) 液相色譜檢測器,a. 紫外檢測器應用最廣，對大部分有機化合物有響應。特點： 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm 10mm，容積8L）； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。,一些常用溶劑的紫外截止波長,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。,光電二極管陣列檢測器,c. 示差折光檢測器（diffe

5、rential refractive index detector）,除紫外檢測器之外應用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測器（每種物質具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉式、反射式和干涉型三種。,示差折光檢測器,d. 熒光檢測器（fluorescence detector）,高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應。,17-2 基本理論,一 色譜柱柱效的基本關系式,二 分離度,三 速率方程,溶質在液相流動相中的擴散系數(shù)，約為氣相中擴散系

6、數(shù)的萬分之一,流動相流速對板高的影響,1)小顆粒填料，填充均勻；2) 選擇較低的流動相流速；3) 選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質。,修正的速率方程：,提高柱效途徑,17-3 高效液相色譜分離方法,一(液-固)吸附色譜法,1.,吸附劑一般為多孔性的物質，在它們的表面存在著分散的吸附中心，溶質分子和流動相分子在吸附劑表面的活性中心上進行競爭，同時不同溶質之間和同一溶質的不同官能團之間也存在競爭。競爭的綜合結果就是形成不同溶質在吸附劑表面吸附、解吸平衡。,2 分離原理,Kad值越大，保留時間越長。,可表式為：,吸附色譜的分離機理,隨著樣品在固定相上的吸附能力由大到小在色譜柱上的保留由長到短,硅膠

7、表面結構,硅膠表面結構經(jīng)熱處理發(fā)生的變化,缺 點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。,極性吸附劑上有機化合物的保留順序如下：氟碳化合物飽和烴 烯烴芳烴有機鹵化物醚硝基化合物腈叔胺酯醛酮醇伯胺酰胺羧酸磺酸,3 流動相(洗脫劑),越大，表明流動相溶劑分子對吸附劑的親和能力越強，則越易從吸附劑上將被吸附的溶質洗脫下來。,溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附自由能,溶劑強度參數(shù),各種不同極性的一元或多元溶劑。,硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯,流動相：干燥正庚烷,1份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷,水飽和的正庚烷,改變流動相的組成可改變分離的選擇性,4 應用,具有不同官能團的化合物具有相同官能團，但數(shù)量

8、不同的化合物異構體,例：幾種取代位置不同的硝基苯胺的分離。在硅膠吸附劑上的滯留順序：,鄰位間位對位,適合分離的物質,吸附色譜概述,分離基于樣品的極性差異。洗脫次序一般為正相，即：極性低的先被洗脫常用的流動相非極性有機溶劑，如己烷常用固定相硅膠、氧化鋁。,二 分配色譜法,1.分離原理,K不僅與固定相的種類有關，也與流動相的種類有關,固定相與流動相均為液體（互不相溶）；,分配色譜的分離機理,正相分配色譜,組分極性越大，保留時間越長,反相分配色譜,組分極性越小，保留時間越長,2.流 動 相：,對于親水性固定液，采用疏水性流動相.即：,當流 動相的極性大于固定液的極性時：,固 定 相： 早期涂漬固定液

9、，固定液流失，較少采用；化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠 （擔體）表面的游離羥基上。 如 C-18柱（反相柱）。（詳見后面）,分配色譜概述,反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫常用的流動相：有機溶劑如甲醇、乙腈，水應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基團反相色譜固定相多為鍵合相,1 固定相,陽離子：SO3H(強)CO2H(弱)陰離子：N+R3(強)NH2 (弱),基質,合成樹脂纖維素硅膠,離子交換劑,陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；,三 離子交換色譜法,2022/7/14,47,可編輯,2

10、流動相,水相緩沖液+有機改性劑,調節(jié)選擇性的主要參數(shù),鹽種類及濃度pH值,陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液； 陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；,各種陰離子在陰離子交換劑上的滯留次序：,*用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快,陽離子交換樹脂,陽離子交換,陰離子交換,3. 分離原理,陰離子交換,4 應用,離子及可離解的化合物如：氨基酸、核酸、蛋白質等,離子交換樹脂的分離機理,離子交換色譜概述,適用于離子型化合物的分離分離基于離子的帶電特性洗脫次序受多種因素的影響填料（離子交換樹脂）的種類陰/陽，強/弱，交換基團樣品分子特性鹽的種類、濃度溫度及pH值有機溶劑,四、離子色譜 （ion

11、 chromatography）,離子色譜是在20世紀70年代中期發(fā)展起來的一中技術，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術和電導檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。 圖片,二、離子色譜儀器,淋洗液,泵,色譜柱,檢測器,泵液,分離,檢測,記錄,進樣閥,抑制器,檢測池,進樣,離子色譜基本原理 離子色譜中發(fā)生的基本過程就是離子交換，因此，離子色譜本質上就是離子交換色譜。,在離子色譜的基本組成中，重要的和與其他高效液相色譜不同的就是抑制器和電導檢測器。,抑制器的作用,廢液,陰離子抑制器,抑制器的作用,淋洗液(Na2CO3),分析柱,HF

12、, HCI, H2SO4 in H2CO3,NaF, NaCl, Na2SO4 in Na2CO3,廢液,H2O,不經(jīng)過抑制,對離子,S,時間,S,時間,經(jīng)過抑制,廢液,H2O,H+,Na+,12943,樣品 F , CI , SO42,-,-,-,F,SO42,CI,-,-,-,F,SO42,CI,-,-,-,負極,正極,OH-,自動連續(xù)再生陰離子抑制器中電化學反應和離子移動,五、離子對色譜 （ion pair chromatography）,原理：將一種（或多種）與溶質離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質離子結合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；,陰

13、離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離 子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+X - 后；在兩相間分配。,六 尺寸排阻(凝膠)色譜法,排阻色譜分離示意圖,相對分子質量差別大于10的化合物才可以分離,1 分離原理,體積排除色譜的分離機理,2 固定相,是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結構的多聚體，其中含有大量液體（一般是水），柔軟而富于彈性。,凝膠,3 流動相,不采用改變流動相組成的方法控制分離度,凝膠色譜概

14、述,分離基于分子在溶液中的體積大小 洗脫次序：大分子先被洗脫 流動相不參與分離，只起溶劑作用 分離效率低 色譜行為容易預測,分離方法的選擇,七、親和色譜(AC) （Affinity chromatograph）,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。,第三節(jié) 液相色譜的固定相與流動相,一、液相色譜固定相,1. 液-液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅

15、藻土等制成的多孔球體；早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多 見；現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；,（2）表面多孔型擔體 （薄殼型微珠擔體）3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為12m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；,二. 化學鍵合相色譜,采用化學鍵合相的液相色譜,1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快；2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； 4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；5）有利于梯度洗脫；,特點,存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理) 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附

16、為主；缺點pH值不能小于3,1. 鍵合固定相制備,ODS(C18)鍵合相,硅膠,十八烷基氯硅烷,非極性,硅烷化反應,使用pH范圍： 2-8,化學鍵合固定相: 目前應用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,鍵合固定相類型,疏水基團烷烴（C8和C18）、苯基等,極性基團丙氨基氰乙基醚和醇等,離子交換基團胺基、季銨鹽磺酸、羧酸,2. 鍵合相色譜法分類,反相鍵合相色譜:,常用固定相：C18,分離對象非極性中等極性化合物,常用流動相甲醇-水乙睛-水,反相鍵合相色譜疏溶劑分離機制,固定相極性流動相極性,反相色譜最常用的流動相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水甲醇體系：大約50水的時候粘度最大水乙腈體系：35水的時候粘度最大。,正相鍵合相色譜 固定相極性 流動相極性,離子性鍵合相色譜 將各種離子交換基團化學鍵合到硅膠基質表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。,例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇-水,出峰順序：苯酚，甲