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1、第九章 基因工程技術育種,第一節(jié) 基因工程概述第二節(jié) 魚類的基因工程技術育種,1、概念：是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。,第一節(jié) 基因工程概述,也稱為DNA重組技術(DNA Recombination)或分子克隆(Molecular cloning),2、誕生：1971年，美國Smith,H.O.等分離出一種限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；1972年：erg, P.等實現(xiàn)不同酶切DNA片段的體外連接； 1973年：Cohen,s.等將體外重組的DNA 轉入大腸桿菌細胞并得以表達。,、基本過程

2、：, 從供體細胞中分離出目的基因 (“切”) ； 用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子(“接”)； 借助細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞(“轉”)； 培養(yǎng)轉化細胞，以擴增DNA重組分子，使其整合到受體細胞的基因組中（“增”）； 鑒定轉化細胞，獲得外源基因高效表達細胞（“檢”）；基因工程的操作過程可簡化為：切、接、轉、增、檢,目的基因的分離與鑒定,(一) 從基因庫中分離基因 (二) 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因(三) 人工合成基因,限制性內(nèi)切核酸酶 (restriction enzymes)： 在細菌中此酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(rest

3、riction )或阻止病毒侵染。 第類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列回紋對稱序列。,載體,一個DNA片段只有與適合的載體DNA連接構成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(host cell)，并在其中復制、擴增、克隆出多個拷貝?？勺鳛镈NA載體的有質粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。,(vector),作為載體DNA分子，需具備四個條件：具復制原點(ori)，能攜帶的外源DNA片段獨立地自我復制；具有多克隆位點，即具有多種限制性酶的切點，用于克隆外源DNA片段；至少具有一個選擇標記基因；易從宿主細胞

4、中回收。,1. 細菌質粒,質粒是細菌細胞內(nèi)獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復制、易分離和導入的環(huán)狀雙鏈DNA分子。這些質粒的適應范圍廣，拷貝數(shù)多。進入宿主細胞復制后，每個細胞的質?？截悢?shù)可高達1000個。,2. 噬菌體,3. 穿梭載體,DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸根和3-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應需要供給能量，大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。,DNA連接酶(DNA ligase),修復雙鏈DNA缺口處的磷酸二酯鍵,連接多個平頭雙鏈DNA分子：,目的基因與載體的連接(DNA分子重組),重組DNA分子導入

5、宿主細胞, 轉化(transformation):指將質粒DNA或以它為載體構建的重組質粒導入細菌中的過程。 轉染(transfection):指病毒及其重組子導入受體細胞的過程. 轉導(transduction):指噬菌體及其重組子導入受體細胞的過程,轉化,(1)氯化鈣法 1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當處理及短暫熱休克之后,便能吸收噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學 S.Cohen報道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細胞也能攝取質粒DNA。,(2)電穿孔法,電穿孔法(electroporation):是指在一個較大的電脈沖短暫破壞細胞膜的脂質雙層，從而允許DN

6、A等分子通過細胞膜進入細胞，而后細胞膜快速復原，保持細胞的完整。這種方法稱為電穿孔法。,轉化子的鑒定轉化子的外源基因表達, 4. 基因工程的應用,(一) 基因工程工業(yè)(二) 植物基因工程(三) 轉基因動物(四) 基因治療,胰島素的人工生產(chǎn),植物基因工程,根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉化植物基因轉化：是指將外源基因轉移到植物細胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達的過程。根癌農(nóng)桿菌介導的植物轉化,轉基因動物,與轉基因植物相比，轉基因動物的發(fā)展要慢些。 例如，利用轉基因羊大量表達人類的抗胰蛋白酶。將人的抗胰蛋白酶-1基因克隆在羊奶產(chǎn)生相關基因啟動子的下游，這種啟動子僅在乳腺細胞中表達，使羊奶中含有大量有

7、功能的人類抗胰蛋白酶；可利用家禽作為生物反應器，生產(chǎn)人類大量需要的重要蛋白質。,基因治療,利用基因工程技術，將特異基因導入并整合到具有遺傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病的方法，通常叫做基因治療(gene therapy)。目前最常用的方法是利用病毒DNA作載體，構建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組去毒病毒感染患者的細胞，將正?；蛘系饺旧w上。,第二節(jié) 魚類基因工程,以魚類為研究對象，應用基因工程技術于魚類遺傳育種和海水魚類資源開發(fā)研究的一門應用性，技術強的分支學科。 本節(jié)以海洋魚類為研究對象進行介紹。,進入上世紀90年代，我國水產(chǎn)品總量已躍居世界首位，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈

8、產(chǎn)量，水產(chǎn)業(yè)的發(fā)展由捕撈型轉向增養(yǎng)型。 其中，海水養(yǎng)殖的發(fā)展尤為迅速。相比貝類和蝦類養(yǎng)殖，海水魚類的養(yǎng)殖發(fā)展較慢。 制約因素較大的是越冬問題，多數(shù)海水養(yǎng)殖品種在4以上才能越冬，8 以上才能攝食和維持緩慢生長。其次海水魚的遺傳育種和全人工繁殖育苗問題尚未徹底解決，育苗成活率較低。,根據(jù)目前研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢，海水魚類基因工程的研究內(nèi)容主要為：分離和克隆海水魚類中的有用基因;篩選適用海水魚類基因克隆和表達的載體及表達體系。利用轉基因技術，將外源基因導入海水魚中，培育性狀優(yōu)良的轉基因海水魚類品系。,1. 海水魚類基因的分離和克隆,基因的分離包括構建基因文庫和從基因文庫中篩選分離目的基因兩大步驟。 幾

9、種重要的海水魚類基因 生長激素基因 抗凍蛋白基因 催乳素基因和生長催乳素基因,抗凍蛋白基因,大多數(shù)海水魚類的血清在-0.6 即凍結，因此無法在溫度過低的海域中生存，但仍有一些海水魚類可以生存在這些嚴寒海域中。 早在1957年，Scholander等人首次觀察和研究了這些魚類的抗凍特性。他們發(fā)現(xiàn)在北極海水魚的血清中存在一種生物大分子，它們起著降低血清凝固點的作用。 此后，DeVries等人從南極魚血清中分離和分析了這種生物大分子，發(fā)現(xiàn)它們是一類有特殊化學結構的糖蛋白，稱為抗凍糖蛋白（AFGP）。,上世紀80年代，加拿大Choy 等人發(fā)現(xiàn)了另一類抗凍蛋白。他們從產(chǎn)自北大西洋沿岸海域的美洲大綿鳚、冬

10、鰈和杜父魚中分離出3種類型的抗凍蛋白（AFP）。當AFP增至一定濃度，可以完全抑制冰晶的形成，因此即使在低于-1.7的低溫條件下，含有一定濃度AFP的血清也不會凍結，這就是極地和北大西洋海域的海水魚能夠在嚴寒海水中生存的原因。,用這幾種抗凍蛋白基因構建的各種表達重組體已經(jīng)成功地應用于轉抗凍蛋白基因魚類的研究和基因工程菌表達生產(chǎn)抗凍蛋白的應用研究。,2. 海水魚類的基因轉移,在海水魚類基因工程育種研究方面，目前所開展的工作主要是應用轉基因技術將外源目的基因導入受體魚類的生殖系細胞內(nèi)，使之整合于受體細胞的染色體中，通過改變受體魚遺傳物質組成的方式達到培育優(yōu)良性狀的新品種的目的。,魚類轉基因技術研究

11、始于淡水魚。1985年，我國學者朱作言等人首次報道了轉基因魚試驗成功。他們將小鼠金屬硫蛋白啟動子-人生長激素基因組體（mMT-hGH）導入金魚受精卵中，獲得了第一批轉基因魚。海水魚類的轉基因研究直到90年代初才有報道，加拿大研究者成功地將海水魚的生長激素基因和抗凍蛋白基因導入鮭科魚類，培育出個體較對照魚30倍的“超級魚”和能夠表達抗凍蛋白的轉基因大西洋鮭。我國 研究者在世紀初也將海水魚生長激素成 功導入我國重要的海水經(jīng)濟魚類真鯛和 牙鲆，培育出生長速度明顯加快的轉基 因海魚群體。,魚類作為轉基因研究的實驗動物，比哺乳動物等具有更多的優(yōu)點：魚類懷卵量大，一次可產(chǎn)幾萬個至幾十萬個；大多數(shù)種魚類的卵

12、子卵徑大，卵質透明，便于進行顯微注射等遺傳操作；魚類是體外受精體外發(fā)育，易于進行人工受精和控制胚胎發(fā)育的條件。,2.1.顯微注射法 顯微注射法是目前最常用的方法，導入外源基因的成功率也比較高。主要包括兩種方式： (1)卵母細胞的細胞核注射； (2)受精卵的細胞質注射。,顯微注射法的優(yōu)點是外源基因的導入整合效率較高，缺點是需要貴重精密儀器，技術操作難度較大，并且外源基因的整合位點和整合的拷貝數(shù)都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。并且，顯微操作處理對魚類卵子有機械損傷，受精卵的成活率受到很大影響。,2.2 電脈沖法,外源DNA在電脈沖作用下進入受精卵。,謝岳峰

13、等(1989)以泥鰍脫膜受精卵為材料，電穿孔轉移外源基因，獲得了10% 的轉基因泥鰍。Powers(1992)采用電穿孔法和顯微注射法，將線性化DNA 導入斑馬魚、斑鲴和鯉受精卵。電穿孔法產(chǎn)生的轉基因魚數(shù)量比顯微法的多。Zhao(1993)證明電穿孔導入的GH 基因不僅能表達，而且還能遺傳。Powers(1992)采用電穿孔法獲得的轉基因斑馬魚和鯉的子一代約一半攜帶外源基因并能有效表達。,缺點,優(yōu)點,操作比較簡單，是處理大量的受精卵的理想方法。,缺點是導入無定向性，轉移率較低，針對不同種魚需要建立相應的電脈沖條件(脈沖電壓、脈沖時間、脈沖次數(shù)、間隔時間、脈沖介質)等。,2.3 精子載體導入法,

14、利用精子作為轉基因載體，借助受精作用把外源基因導入受精卵，整合到受精卵的基因組中，是構建轉基因動物的一種新的嘗試。,目前魚類的成功報道有6種。Khoo等(1992)將斑馬魚精子與pUSVCAT質粒在PBS中22保育3040 min，得到23.3% (環(huán)狀質粒DNA)和37.5% (線狀質粒DNA)的陽性率。Sin等(1993)將大鱗大麻哈魚的精子與外源基因混合，經(jīng)電脈沖處理后再受精，獲得510%的轉基因陽性率。于健康等(1994)將金魚精子與AFP基因在NiuTwitty液中4 保溫30 min后，再與卵子受精，經(jīng)PCR 法和Southern blot分子雜交法檢查，陽性率為26%。,該法較簡

15、單、方便，依靠生理受精過程，免去了對原核的損傷。通過此法獲得的精卵受精和受精卵成活率幾乎不會受到影響。但精子攜帶基因轉移法仍存在轉基因陽性率低、轉移率不穩(wěn)定等缺點。,2.4 染色體片段顯微注入法,這是一種超大型外源DNA 轉移獲得轉移染色體魚的方法。就是從染色體上顯微切割特定的染色體片段，然后注入受體動物受精卵中。,3. 外源基因整合的檢測方法,轉基因魚是要求外源DNA分子能夠插入宿主細胞的染色體DNA分子中。整合至宿主細胞基因組中，只有這樣才能達到改變后者遺傳物質組成，從而改變其遺傳性狀的目的。因此，整合率才真正反映了轉基因的效率。影響整合率的主要因素有以下幾個方面： （1）外源基因導入的時

16、期。最好選擇細胞分裂中期，細胞核膜消失，核染色體較為分散狀態(tài)時，外源DNA分子有更多機會與宿主基因組DNA分子接觸和作用。,（2）外源基因導入的部位。一般認為外源DNA分子導入卵細胞核內(nèi)最佳。在淡水魚轉基因研究中，已經(jīng)報道了利用卵母細胞顯微注射法進行金魚轉基因試驗成功的結果。在海水魚方面，至今尚未見成功的報道，主要是因為尚未解決海水魚卵母細胞體外成熟的問題。因此目前海水魚轉基因操作主要是控制外源基因導入的時期。,外源基因整合的檢測：有DNA點雜交，Southern雜交及PCR反應等方法。,4. 外源基因表達的檢測,整合至受體魚染色體中的外源基因是否能在導入的外源啟動子作用下正常表達，需要進行外源基因表達的檢測?；虻谋磉_分為轉錄水平和翻譯水平兩級。,研究進展：據(jù)認為，轉基因魚是目前國內(nèi)最早成功的一種轉基因動物。早在1985年，朱作言等就率先在世界上獲得轉基因鯽魚，后來又先后獲得了轉基因泥鰍、鯉、團頭魴和鯪等。從總體上看，我國魚類基因轉移技術已達到世界先進水平。,關于促進魚類生長的生長激素基因工程方面，加拿大、日本、美國、英國等國家的科學工作者都有研究。英國南安普教大學用基因工程技術培育