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1、蛋白質與酶工程 酶的提取分離和純化一、概述一、概述二、酶的提取二、酶的提取三、酶的分離純化三、酶的分離純化四、酶的結晶四、酶的結晶五、濃縮與干燥五、濃縮與干燥六、酶純化步驟的設計及評價六、酶純化步驟的設計及評價酶的提取、分離和純化 一、概述一、概述 1-1 1-1 酶提取與分離純化的定義酶提取與分離純化的定義 將酶從細胞或其它含酶原料中將酶從細胞或其它含酶原料中提取提取出來，出來，再與再與其它物質分開其它物質分開，從而獲得所需酶的技術，從而獲得所需酶的技術過程過程 *酶的純化程度根據(jù)酶的純化程度根據(jù)需要需要而定而定 *純化方法多種多樣，為獲得較好的效純化方法多種多樣，為獲得較好的效果往往是果往

2、往是2 2種或種或2 2種以上種以上聯(lián)合應用聯(lián)合應用 1-2 1-2 提取純化之目的提取純化之目的1)1)酶催化功能的應用酶催化功能的應用2)2)酶學研究酶學研究 酶的結構、功能、催化機制、催化動力學酶的結構、功能、催化機制、催化動力學 酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等酶的生物合成及其調(diào)控規(guī)律等 1-3 1-3 純化的必要性純化的必要性1)1)生物細胞中同時存在多種多樣的酶生物細胞中同時存在多種多樣的酶2)2)多酶可能作用于同一個底物多酶可能作用于同一個底物3)3)酶在生物細胞中的分布并不是均一的酶在生物細胞中的分布并不是均一的二、酶的提取二、酶的提取（extraction)extraction)2

3、-1 2-1 了解所分離酶在細胞中的分布了解所分離酶在細胞中的分布 1 1、細胞外酶：、細胞外酶：由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用由細胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到胞外發(fā)揮作用的酶；大多屬于的酶；大多屬于水解酶水解酶，通常含量高，容易得到，通常含量高，容易得到2 2、細胞內(nèi)酶、細胞內(nèi)酶：在細胞內(nèi)合成后并不分泌到細胞外，：在細胞內(nèi)合成后并不分泌到細胞外，而在細胞內(nèi)起催化作用。該類酶在細胞內(nèi)往往與而在細胞內(nèi)起催化作用。該類酶在細胞內(nèi)往往與細胞器結合，不僅有一定的細胞器結合，不僅有一定的區(qū)域性，區(qū)域性，而且催化的而且催化的反應具有一定反應具有一定順序性順序性 v真核細胞內(nèi)酶的分布真核細胞內(nèi)酶的分布細胞膜：細胞膜：

4、ATPATP酶、腺苷酸環(huán)化酶等酶、腺苷酸環(huán)化酶等細胞核：細胞核：DNADNA聚合酶、連接酶和聚合酶、連接酶和RNARNA聚合酶等聚合酶等線粒體線粒體：三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化、尿素循環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質合成、環(huán)、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白質合成、DNADNA聚聚合酶、合酶、RNARNA聚合酶等聚合酶等高爾基體：高爾基體：多糖、核蛋白粘液生成酶多糖、核蛋白粘液生成酶溶酶體：溶酶體：各種水解酶等各種水解酶等葉綠體：葉綠體：參與光合作用形成參與光合作用形成ATPATP、NADPHNADPH有關的酶有關的酶類、與暗反應有關的酶系類

5、、與暗反應有關的酶系線粒體主要酶的分布（約有線粒體主要酶的分布（約有120120種酶）種酶）部部 位位酶酶 的的 名名 稱稱外外 膜膜單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、單胺氧化酶、犬尿氨酸羥化酶、NADH-NADH-細胞色素細胞色素C C還原酶、還原酶、脂類代謝有關的酶（酰基輔酶脂類代謝有關的酶（?；o酶A A合成酶、脂肪酸激酶等）合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：特征酶：單胺氧化酶單胺氧化酶膜膜 間間 隙隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亞硫酸氧化酶特征酶：特征酶：腺苷酸激酶腺苷酸激酶內(nèi)內(nèi) 膜膜細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫

6、酶、NADHNADH脫氫酶、肉堿?；摎涿浮⑷鈮A?；D移酶、轉移酶、-羥丁酸和羥丁酸和 -羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、羥丙酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、ATPATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體合成酶系、腺嘌呤核苷酸載體特征酶：特征酶：細胞色素（細胞色素（c c）氧化酶）氧化酶基基 質質檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合體、天冬氨延胡索酸酶、谷氨酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶復合體、天冬氨酸氨基轉移酶、蛋白質和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系酸氨基轉移酶、蛋白質和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：特

7、征酶：蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶2-2 2-2 起始材料的選擇起始材料的選擇 原則：原則：選取酶含量高的材料選取酶含量高的材料 可以是可以是天然天然的動植物的動植物 或或人工培養(yǎng)人工培養(yǎng)的微生物、動植物細胞等的微生物、動植物細胞等 *注意材料的生長階段注意材料的生長階段 *注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域注意酶在生物體內(nèi)的富集區(qū)域 由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到到原料原料和和成本的限制成本的限制，因此，目前，因此，目前工業(yè)上工業(yè)上大多采大多采用培養(yǎng)微生物用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑的方法來獲得大量的酶制劑2-3 2-3 細胞膜和細胞壁的破碎細胞膜

8、和細胞壁的破碎1 1、主要方法：、主要方法：1 1）2 2）l超聲波破碎法超聲波破碎法 3 3）4 4）2 2、選擇原則、選擇原則如酶法+超聲 2-4 2-4 酶的提取酶的提取 1 1、定義、定義 在適當條件下，用適當?shù)奶崛∫禾幚砗冈?，在適當條件下，用適當?shù)奶崛∫禾幚砗冈?，使使酶充分溶于其中酶充分溶于其中的過程。的過程。2 2、提取液的選擇、提取液的選擇 根據(jù)酶的結構根據(jù)酶的結構和和溶解特性溶解特性來選擇適當?shù)奶崛∫簛磉x擇適當?shù)奶崛∫?*極性物質極性物質易溶解于易溶解于極性溶劑，極性溶劑，反之，反之，即即相似相溶相似相溶 *酸性物質酸性物質易溶解于易溶解于堿性溶液堿性溶液，反之亦然。反

9、之亦然。2-4 2-4 酶的提取酶的提取3 3、常用的提取液：酶通常都溶于、常用的提取液：酶通常都溶于水水，因此通常用水，因此通常用水作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶作為溶劑，配制成一定濃度的稀酸、稀堿、稀鹽溶液進行抽提液進行抽提4 4、有些酶、有些酶與脂質結合與脂質結合或或含有較多的非極性基團含有較多的非極性基團，則則可用可用有機溶劑抽提，如：有機溶劑抽提，如：丙酮粉，丙酮粉，有助于有助于酶與脂肪酶與脂肪或磷脂膜分離；或磷脂膜分離；高離子強度水溶液也高離子強度水溶液也有助于有助于酶從結合的膜上解酶從結合的膜上解析下來。析下來。2-5 2-5 主要的提取方法主要的提取方法1 1、鹽

10、溶液提取、鹽溶液提取 該法用于在該法用于在低濃度鹽溶液中溶解度大的酶低濃度鹽溶液中溶解度大的酶的提取的提取 常用的鹽濃度：常用的鹽濃度：0.02-0.05mol/L0.02-0.05mol/L，大多數(shù)，大多數(shù)P P酶酶用該用該 法提取法提取 R R酶酶常用常用0.14mol/L0.14mol/L的的NaClNaCl溶液提取。溶液提取。*鹽溶現(xiàn)象：鹽溶現(xiàn)象：低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高低鹽條件下，酶在水中的溶解度隨鹽濃度升高而增加的現(xiàn)象而增加的現(xiàn)象 *鹽析現(xiàn)象：鹽析現(xiàn)象：當鹽濃度達到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽當鹽濃度達到一定界限后，酶的溶解度則隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象濃度升高而降低

11、的現(xiàn)象2 2、酸溶液提取、酸溶液提取 在酸性條件下在酸性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶可用此法的酶可用此法 如：胰蛋白酶（如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用可用0.12mol/L0.12mol/L的硫酸的硫酸溶液溶液3 3、堿溶液提取、堿溶液提取 在堿性條件下在堿性條件下溶解度大并穩(wěn)定溶解度大并穩(wěn)定的酶該法適用的酶該法適用 如：大腸埃希菌的如：大腸埃希菌的L-L-天冬酰胺酶（天冬酰胺酶（pI=4.85）可可用用pH11-12.5pH11-12.5的溶液的溶液 4 4、有機溶劑提取：如、有機溶劑提取：如酶與脂質結合牢固，或含有酶與脂質結合牢固，或含有較多非極性基團的酶，可用較多非極性基團的

12、酶，可用與水混溶的有機溶劑與水混溶的有機溶劑（乙醇、丙酮、丁醇等），（乙醇、丙酮、丁醇等），如：如：P P酶：酶：膽堿酯酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫膽堿酯酶、細胞色素氧化酶、琥珀酸脫氫酶等用酶等用丁醇丁醇萃取，有較好效果萃取，有較好效果 R R酶：酶：可用可用酸苯酚溶液酸苯酚溶液提取提取 主要的提取方法小結主要的提取方法小結地5 5、影響酶提取的其它重要因素、影響酶提取的其它重要因素l溫度：溫度：適當提高，適當提高，可以提高酶的溶解度和酶分子可以提高酶的溶解度和酶分子的擴散速度；的擴散速度；過高過高則引起酶失活則引起酶失活lpH:pH:在等電點條件下，酶的溶解度最?。粸樘岣咴诘入婞c條件下，酶

13、的溶解度最??；為提高溶解度，要溶解度，要避開酶的等電點避開酶的等電點;但是，也但是，也不宜偏離不宜偏離pIpI太遠太遠（過高或過低），以免引起（過高或過低），以免引起酶變性失活酶變性失活l 提取液體積提取液體積 *適當增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率適當增加其體積，可以提高酶的產(chǎn)率 *過量，則降低過量，則降低 酶酶，增加后續(xù)分離純化的難度，增加后續(xù)分離純化的難度 一般為一般為原始材料的原始材料的3-53-5倍，倍，且分且分3 3次使用次使用 l 加入保護劑，加入保護劑，以提高酶的穩(wěn)定性以提高酶的穩(wěn)定性 如酶的如酶的底物、輔酶底物、輔酶和某些和某些抗氧化劑抗氧化劑 三、酶的分離純化三、酶的分離純化（

14、isolation,separation)(purification)isolation,separation)(purification)3-1 3-1 分離純化方法分類分離純化方法分類 1 1、基于分子大小或質量、基于分子大小或質量 (1)(1)離心離心 (2)(2)透析透析 (3)(3)凝膠過濾凝膠過濾 (4)(4)超過濾超過濾 2 2、基于電荷、基于電荷 (1)(1)離子交換色譜離子交換色譜 (2)(2)電泳電泳 (3)(3)等電聚焦等電聚焦 3 3、基于溶解度、基于溶解度 改變改變pHpH、離子強度、介電常數(shù)等實現(xiàn)的、離子強度、介電常數(shù)等實現(xiàn)的沉淀分離：沉淀分離：(1)(1)鹽析法鹽

15、析法 (2)(2)復合沉淀法復合沉淀法 (3)(3)有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 (4)(4)等電點沉淀法等電點沉淀法 (5)(5)選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法4 4、基于特異性結合位置、基于特異性結合位置/親和力的差異親和力的差異 親和色譜（層析）親和色譜（層析）5 5、其它方法（略）、其它方法（略）（1 1）基于分配系數(shù)的差異：）基于分配系數(shù)的差異：雙水相系統(tǒng)萃取法雙水相系統(tǒng)萃取法 （2 2）基于疏水作用的差異：疏水層析）基于疏水作用的差異：疏水層析 （3 3）在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附）在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附 （4 4）羥基磷灰石色譜）羥基磷灰石色譜 （5 5）冷凍干燥（濃縮）冷凍干

16、燥（濃縮）1 1、沉淀分離、沉淀分離3-2 3-2 常用的分離純化方法常用的分離純化方法取正常人血清5ml加等量生理鹽水混勻攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨使飽和度為204，10min離心(3000rpm),10min，棄沉淀 上清繼續(xù)滴加飽和硫酸銨使飽和度為50。置4，3小時以上離心(3000rpm),10min，棄上清所得沉淀物以0.02M PH7.4 PBS溶解至5ml 裝入透析袋中對PBS充分透析（換液3次）萘氏試劑測透析外液無黃色取少許透析袋液適當倍數(shù)稀釋后，測蛋白含量。例例 鹽析純化血清免疫球蛋白鹽析純化血清免疫球蛋白2 2、離心（、離心（centrifugation)centrifugation)（1 1）定義：）定義：利用離心機旋轉產(chǎn)生的離心力，使利用離心機旋轉產(chǎn)生的離心力，使不不同大小、不同密度同大小、不同密度的顆粒分離的技術過程。的顆粒分離的技術過程。*優(yōu)點：優(yōu)點：處理量大，可達幾升處理量大，可達幾升 *離心條件的選擇：離心條件的選擇：以靶酶與雜質的顆粒大小、以靶酶與雜質的顆粒大小、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當?shù)碾x心機、密度和特性的差異為依據(jù)，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法