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1、紅霉素的發(fā)酵工藝及提取工藝 報(bào)告人趙訓(xùn)平小組成員：陳云、杜婧文，李安、陳哲紅霉素的產(chǎn)生菌及育種 1950年，Lily研究室首次從菲律賓的一個(gè)土樣中篩選到了一株產(chǎn)紅霉素的紅色鏈霉素現(xiàn)稱為紅色糖多胞菌。該菌在合成培養(yǎng)基上生長時(shí)，氣生菌絲為白色，孢子絲呈不緊密的螺旋狀，35圈，孢子呈球狀 我國20世紀(jì)60年代以紅色糖多胞菌P32103為菌種開始紅霉素的工業(yè)生產(chǎn)，該菌發(fā)酵效價(jià)低，且易染噬菌體。隨后，國內(nèi)學(xué)者不斷以該菌為原始菌進(jìn)行了傳統(tǒng)的誘變育種，獲得許多生產(chǎn)性能良好的菌株。紅霉素的發(fā)酵工藝 孢子培養(yǎng) 孢子培養(yǎng) 沙土孢子 母瓶斜面培養(yǎng) 37 7 10 h 37 7 10 h 種子罐培養(yǎng) 子瓶斜面培 34

2、 35 60 70h 種子罐培養(yǎng) 發(fā)酵 一級種子液 二級種子液 32 35 3032h 31 150160h 發(fā)酵液 紅霉素的發(fā)酵工藝 1種子培養(yǎng)：1生產(chǎn)孢子的制備：紅色糖多胞菌斜面孢子培養(yǎng)基由淀粉、玉米漿、硫酸銨等組成，孢子培養(yǎng)的溫度為37，濕度50左右。母瓶斜面培養(yǎng)9d，子瓶斜面培養(yǎng)7d。成熟的孢子呈深米黃色，色澤鮮艷、均勻、無黑點(diǎn)，孢子瓶背面有紅色色素。2生產(chǎn)種子的制備：種子罐及繁殖罐的培養(yǎng)基由淀粉、葡萄糖、花生餅粉、蛋白胨、硫酸銨和碳酸鈣等組成，滅菌后將子瓶斜面孢子制成孢子懸液，用微控注射的方式接 入種子罐。種子培養(yǎng)溫度為35，培養(yǎng)時(shí)間為65h，繁殖罐培養(yǎng)溫度為33，培養(yǎng)時(shí)間為3032

3、h左右。種子培養(yǎng)成熟并經(jīng)檢驗(yàn)合格后以10的接種量移入發(fā)酵罐。紅霉素的發(fā)酵工藝 2培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基最適合的碳源為蔗糖、其次為葡萄糖、淀粉、糊精。生產(chǎn)上常用葡萄糖和淀粉為混合碳源，效果與使用葡萄糖相似。氮源的代謝對紅霉素合成影響很大，當(dāng)適于菌體生長的氮源耗盡時(shí)，菌體才停止生長并迅速合成紅霉素。紅霉素生產(chǎn)中一般都用有機(jī)氮源，其中以黃豆餅粉、玉米漿為最佳。由于黃豆餅粉菌時(shí)泡沫較多，故一、二級種子罐及后期補(bǔ)料用部分花生餅粉代替，但全用花生餅粉則最終產(chǎn)品會出現(xiàn)帶會現(xiàn)象。在發(fā)酵培養(yǎng)基中加少量硫酸銨，可促進(jìn)菌絲生長。丙酸是紅霉內(nèi)脂合成紅霉素的三中產(chǎn)物之一合成的前體物質(zhì)，但丙酸對菌絲生長有抑制作用，所以發(fā)酵時(shí)

4、以丙醇為發(fā)酵前體物質(zhì)，丙醇在發(fā)酵時(shí)對菌絲的毒性作用相對較小，對pH的影響也較小，代謝穩(wěn)定，發(fā)酵單位和產(chǎn)品質(zhì)量都較高。此外，正丙醇除了起前體作用外，還對紅色糖多孢菌中乙酰CoA合成的誘導(dǎo)物。在無機(jī)元素中，鐵離子抑制紅霉素的合成。紅霉素的發(fā)酵工藝 3）培養(yǎng)條件：（1）溫度：紅霉素發(fā)酵采用31恒溫培養(yǎng)。溫度過高時(shí)，會產(chǎn)生紅霉素C，紅霉素C與紅霉素A結(jié)構(gòu)相似，但毒性卻是紅霉素A的兩倍，（2）pH：整個(gè)發(fā)酵過程中pH維持在6.67.2，菌絲生長良好，發(fā)酵水平穩(wěn)定。紅色糖多孢菌最適生長pH為6.77.0，而紅霉素合成的最適 pH為6.7 6.9。（3）通氣和攪拌：紅霉素發(fā)酵為好氧發(fā)酵。一般地，發(fā)酵最初12

5、h，通氣量保持在0.4vvm（每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值），12h后到放罐可控制在0.81.0vvm。攪拌速度不宜太快，容易損傷菌絲，不利于發(fā)酵紅霉素的發(fā)酵工藝（4）補(bǔ)料：發(fā)酵過程中還原糖濃度控制在1.01.4范圍內(nèi)，每隔6補(bǔ)加葡萄糖一次，直到放罐前1218停止補(bǔ)糖。40后補(bǔ)加有機(jī)氮源，每日34次，若發(fā)酵罐的黏度上升則增加補(bǔ)料量，反之則減少，放罐前24停止補(bǔ)氮。發(fā)酵后期添加氨水可以提高發(fā)酵單位，減少脫水紅霉素的形成，改善產(chǎn)品質(zhì)量，補(bǔ)加硫酸鎂可以改善菌絲生長狀況，提高發(fā)酵單位。前提一般在24后補(bǔ)加（5）發(fā)酵黏度的控制：發(fā)酵液的黏度一定程度上反映了菌絲生長濃度，并對紅霉素A.B.C組分的

6、比例有直接的影響接種 發(fā)酵菌種接種菌齡必須掌握恰當(dāng)時(shí)機(jī)，接種過早或過晚都將不利于發(fā)酵的進(jìn)行。發(fā)酵接入菌種太年輕，前期生長緩慢，產(chǎn)物開始形成時(shí)間推遲，整個(gè)發(fā)酵周期延長；如果太老，菌量雖多，卻導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降，菌體過早自溶。菌體濃度對發(fā)酵的影響及控制 發(fā)酵接種量較大且保持在合適的濃度，則縮短細(xì)菌生長期，使產(chǎn)物合成時(shí)間提前；但是如果接種量過大，超出適宜值，則生長過快，物料黏度增加，導(dǎo)致溶氧不足，最終影響產(chǎn)物合成 碳源對發(fā)酵的影響及其控制按菌體利用快慢而言，分為迅速利用的碳源和緩慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能較迅速地參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解代謝產(chǎn)物，因此有利于菌體生長，但有的分解代謝

7、產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用；后者(如乳糖)為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的生產(chǎn)期，也為許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。氮源對發(fā)酵的影響及其控制氮源有無機(jī)氮源和有機(jī)氮源兩類。如谷氨酸發(fā)酵，當(dāng)NH4+供應(yīng)不足時(shí)，就促使形成-酮戊二酸；過量的NH4+，反而促使谷氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。發(fā)酵培養(yǎng)基一般是選用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸發(fā)酵用銨鹽(硫酸銨或醋酸銨)和麩皮水解液、玉米漿。補(bǔ)加有機(jī)氮源根據(jù)產(chǎn)生菌的代謝情況，可在發(fā)酵過程中添加某些具有調(diào)節(jié)生長代謝作用的有機(jī)氮源，如酵母粉、玉米漿、尿素等。補(bǔ)加無機(jī)氮源補(bǔ)加氨水或硫酸銨是工業(yè)上的常用方法。氨水既可作為無機(jī)

8、氮源，又可調(diào)節(jié)pH值。在抗生素發(fā)酵工業(yè)中，通氨是提高發(fā)酵產(chǎn)量的有效措施。當(dāng)pH值偏高而又需補(bǔ)氮時(shí)，就可補(bǔ)加生理酸性物質(zhì)的硫酸銨，以達(dá)到提高氮含量和調(diào)節(jié)pH值的雙重目的。磷酸鹽對發(fā)酵的影響及其控制磷是微生物菌體生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的，磷酸鹽濃度的控制，對于初級代謝來說，要求不如次級代謝那么嚴(yán)格。對抗生素發(fā)酵來說，常常是采用生長亞適量(對菌體生長不是最適合但又不影響生長的量)的磷酸鹽濃度，其最適濃度取決于菌種特性、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成和來源等因素。工藝控制比如溶氧控制結(jié)合，發(fā)酵時(shí)，在數(shù)1之前我們控制比較小的通氣量（目前我們的發(fā)酵控制點(diǎn)在發(fā)酵6小時(shí)為延遲期），一來節(jié)約成本，二

9、來適應(yīng)地衣芽孢桿菌的發(fā)酵需要；而到了數(shù)1-3的時(shí)期我們采取高通氣量來配合地衣的生產(chǎn)，數(shù)3以后又要降低通風(fēng)量。在發(fā)酵地衣芽孢桿菌時(shí)，形成芽孢期對整個(gè)的發(fā)酵生產(chǎn)至關(guān)重要，很大程度上決定了產(chǎn)量和收率，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)和總結(jié)我們找出了依pH為指標(biāo)的關(guān)鍵控制點(diǎn)。應(yīng)該說這個(gè)小小的細(xì)節(jié)對我們整個(gè)產(chǎn)品的提高起到了很好的保障作用 紅霉素的提取工藝 在堿性條件下，紅霉素一游離堿的形式存在，可容于有機(jī)溶劑中。在堿性的條件下，可與一些酸形成鹽。目前，國內(nèi)外主要采用有機(jī)溶劑萃取或大孔樹脂吸附進(jìn)行提取。1）發(fā)酵液的預(yù)處理：向發(fā)酵液中加入堿式氯化鋁沉淀蛋白質(zhì)，促進(jìn)菌絲結(jié)團(tuán)加快過濾。2）有機(jī)溶劑萃取：（1）防止和去乳化：用酸性的

10、十二烷基磺酸鈉，在堿性條件下留在水相中，使產(chǎn)品色澤有所改進(jìn)。（2）pH：發(fā)酵液堿化時(shí)控制pH在100.4的范圍內(nèi)。（3）溫度：控制提取過程的溫度有利于提高萃取收率。紅霉素的提取工藝 預(yù)處理過濾 提取離心分離 發(fā)酵液 濾洗液 BA萃取液 甩濾、洗滌、干燥 紅霉素乳酸鹽濕晶體 干晶體 溶解 堿化轉(zhuǎn)化 紅霉素溶液 紅霉素堿濕晶體 分離、洗滌、干燥、紅霉素堿成品紅霉素的提煉與精制利用紅霉素不同酸堿度下溶解于不同溶劑特性，發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中，再在適當(dāng)酸性條件下使紅霉素從溶劑中轉(zhuǎn)移到酸性緩沖液中，后在適當(dāng)堿性條件下，使紅霉素再一次轉(zhuǎn)移到溶劑中。溶劑反復(fù)萃取，達(dá)濃縮去雜之目的。發(fā)酵液處理：加0.1-0.

11、2%甲醛溶液、4-6%的ZnSO4，用15-20%的堿液調(diào)pH至8.2-8.8，過濾。濾液處理：算好醋酸丁酯加入量，堿液調(diào)pH至10-10.5，邊加邊攪拌。加適量消乳劑。保溫30-32醋酸丁酯提取液處理：加適量磷酸鹽緩沖液，10%醋酸調(diào)pH至5-5.5，分層，去廢醋酸丁酯，10%NaOH 調(diào)pH到7-8，同時(shí)加適量醋酸丁酯。酸化緩沖液的處理：經(jīng)中和的酸性緩沖提取液保溫35-45，加醋酸丁酸酯萃取，用10%NaOH堿化，調(diào)pH至10-10.3，二次分級萃取，靜置分層，得醋酸丁酯萃取液。經(jīng)冷凍干燥，分裝。THANK YOUSUCCESS2022/10/1115可編輯紅霉素【別名】威霉素;福愛力；新

12、紅康；【外文名】Erythromycin,EM,EMU-V,Eryc,Ethryn,E-Mycin,Gluceptate,Ilotycin紅霉素適應(yīng)癥:紅霉素在臨床上可作為下列感染的選用藥物:1.溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌等所致的急性扁桃體炎、急性咽炎、鼻竇炎。2.溶血性鏈球菌所致猩紅熱、蜂窩織炎。3.肺炎支原體肺炎、肺炎衣原體肺炎。4.氣性壞疽、炭疽、破傷風(fēng)。5.白喉(輔助治療)及白喉帶菌者。6.沙眼衣原體結(jié)膜炎。7.衣原體屬、支原體屬所致泌尿生殖系感染。8.李斯特菌病。9.軍團(tuán)菌病。10.淋球菌感染。11.空腸彎曲菌腸炎。12.厭氧菌所致口腔感染。13.百日咳。14.放線菌病。15.皮膚科主

13、要用于非淋菌性尿道炎(宮頸炎)、淋病、梅毒、軟下疳、衣原體淋巴肉芽腫(性病性淋巴肉芽腫)、痤瘡以及金黃色葡萄球菌性皮膚感染、猩紅熱等紅霉素藥理學(xué)作用:紅霉素是由鏈球菌Streptomyces erythreus所產(chǎn)生的一種堿性抗生素，屬大環(huán)內(nèi)酯類。本藥系抑菌劑，但在高濃度時(shí)對高度敏感的細(xì)菌也具殺菌作用。其作用機(jī)制是可透過細(xì)菌細(xì)胞膜，在接近供位(“P”位)與細(xì)菌核糖體的50S亞基成可逆性結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)結(jié)合至“P”位上，同時(shí)也阻斷多肽鏈自受位(“A”位)至“P”位的位移，使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成受到抑制，從而起抗菌作用。紅霉素僅對分裂活躍的細(xì)菌有效。紅霉素抗菌譜廣，對大多數(shù)革蘭陽性菌、

14、部分革蘭陰性菌及一些非典型致病菌有效。本藥對葡萄球菌屬(包括產(chǎn)酶菌株)、各組鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)梭桿菌、白喉?xiàng)U菌、淋球菌、腦膜炎球菌、流感桿菌、百日咳桿菌、空腸彎曲菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特菌、伊斯雷爾放線菌具有較強(qiáng)的抗菌活性；對梅毒螺旋體、肺炎支原體、鉤端螺旋體、立克次體；衣原體等也有較好的抑制作用。乳糖酸紅霉素為紅霉素的乳糖醛酸鹽(lactobionate)。乳糖酸紅霉素吸收后，水解釋放出活性成分紅霉素。紅霉素可透過細(xì)菌細(xì)胞膜，在接近供位(“P”位)與細(xì)菌核糖體成可逆性結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)結(jié)合至“P”位上，同時(shí)也阻斷多肽鏈自受位(“A”位)至“P”位的位移，使細(xì)菌

15、細(xì)胞蛋白合成受到抑制，從而起抗菌作用。乳糖酸紅霉素對大多數(shù)革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌及一些非典型致病菌有效。本藥對葡萄球菌屬(包括產(chǎn)酶菌株)、各組鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)梭桿菌、白喉?xiàng)U菌、淋球菌、腦膜炎球菌、流感桿菌、百日咳桿菌、空腸彎曲菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特菌、伊斯雷爾放線菌具有較強(qiáng)的抗菌活性；對梅毒螺旋體、肺炎支原體、鉤端螺旋體、立克次體、衣原體等也有較好的抑制作用。紅霉素的分類名稱：一級分類：皮膚科用藥 二級分類：抗生素類藥物 三級分類：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 藥品英文名：Erythromycin 藥品別名：艾狄密新、福愛力、紅絲霉素、紅霉素堿、阿達(dá)霉素、Eritromicina、

16、Ermycin、Eryc、Erythromycin Base、Erythromycinum、Paedlathrocin 藥物劑型 1.腸溶片:0.125g，0.25g；2.眼膏:0.5%；3.軟膏:1%；4.栓劑:0.1g，0.2g。5.注射劑(粉)：0.25g，藥物0.3g。藥理作用 紅霉素是由鏈球菌Streptomyces erythreus所產(chǎn)生的一種堿性抗生素，屬大環(huán)內(nèi)酯類。本藥系抑菌劑，但在高濃度時(shí)對高度敏感的細(xì)菌也具殺菌作用。其作用機(jī)制是可透過細(xì)菌細(xì)胞膜，在接近供位(“P”位)與細(xì)菌核糖體的50S亞基成可逆性結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)結(jié)合至“P”位上，同時(shí)也阻斷多肽鏈自受位(“A”位)至“P”位的位移，使細(xì)菌蛋白質(zhì)合成受到抑制，從而起抗菌作用。紅霉素僅對分裂活躍的細(xì)菌有效。紅霉素抗菌譜廣，對大多數(shù)革蘭陽性菌、部分革蘭陰性菌及一些非典型致病菌有效。本藥對葡萄球菌屬(包括產(chǎn)酶菌株)、各組鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)梭桿菌、白喉?xiàng)U菌、淋球菌、腦膜炎球菌、流感桿菌、百日咳桿菌、空腸彎曲菌屬、軍團(tuán)菌屬、李斯特菌、伊斯雷爾放線菌具有較強(qiáng)的抗菌活性；對梅毒螺旋體、肺炎支原