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1、青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝1青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝 菌種菌種 發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)控制發(fā)酵培養(yǎng)控制 提取精制提取精制 2青霉素類抗生素青霉素類抗生素青霉素青霉素(Penicillin)又稱盤尼西林，是人類發(fā)現(xiàn)的又稱盤尼西林，是人類發(fā)現(xiàn)的第一種抗生素，也是目前全球銷量最大的抗生素。第一種抗生素，也是目前全球銷量最大的抗生素。青霉素是青霉素是-內(nèi)酰胺類抗生素中的一類，是分子中內(nèi)酰胺類抗生素中的一類，是分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的含有青霉烷、能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的系列生長(zhǎng)期起殺菌作用的一類抗生素。系列生長(zhǎng)期起殺菌作用的一

2、類抗生素。一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素。一種高效、低毒、臨床應(yīng)用廣泛的重要抗生素。它的研制成功大大增強(qiáng)了人類抵抗細(xì)菌性感染的它的研制成功大大增強(qiáng)了人類抵抗細(xì)菌性感染的能力，帶動(dòng)了抗生素家族的誕生。能力，帶動(dòng)了抗生素家族的誕生。3青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu) 青霉素是青霉素是-內(nèi)酰胺類抗生素中的一內(nèi)酰胺類抗生素中的一類，具有類，具有-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)；是分子中含內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)；是分子中含有有青霉素母核（青霉素母核（青霉烷青霉烷）的多種化合物）的多種化合物的總稱。的總稱。分子結(jié)構(gòu)球棍模型分子結(jié)構(gòu)球棍模型-內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺環(huán)6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸4青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝5

3、青霉素制備的一般流程圖青霉素制備的一般流程圖菌種菌種孢子制備孢子制備種子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制提取及精制成品檢驗(yàn)成品檢驗(yàn)成品包裝成品包裝前體前體發(fā)酵階段發(fā)酵階段提取精制提取精制6菌種菌種 目前國(guó)內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培目前國(guó)內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素產(chǎn)黃青霉素。7菌種菌種 青霉素最初生產(chǎn)菌為

4、音符型青霉菌，生青霉素最初生產(chǎn)菌為音符型青霉菌，生產(chǎn)能力僅為幾十個(gè)單位，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)能力僅為幾十個(gè)單位，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)需要。后來發(fā)現(xiàn)適合深層培養(yǎng)的新菌種產(chǎn)需要。后來發(fā)現(xiàn)適合深層培養(yǎng)的新菌種產(chǎn)黃青霉，生產(chǎn)能力產(chǎn)黃青霉，生產(chǎn)能力100U/ml100U/ml，經(jīng)不斷，經(jīng)不斷誘變選育，目前平均生產(chǎn)能力誘變選育，目前平均生產(chǎn)能力66000-66000-70000U/ml70000U/ml，國(guó)際最高生產(chǎn)能力已超，國(guó)際最高生產(chǎn)能力已超100000U/ml100000U/ml。8青霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)過程青霉素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)過程分生孢子發(fā)芽期分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒形成期脂肪粒減少

5、，小空孢脂肪粒減少，小空孢大空孢大空孢自溶自溶菌絲生長(zhǎng)期菌絲生長(zhǎng)期青霉素分泌期青霉素分泌期菌絲自溶期菌絲自溶期9 14期為菌絲生長(zhǎng)期，期為菌絲生長(zhǎng)期，3期的菌體適宜為種期的菌體適宜為種子。子。45期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工期為生產(chǎn)期，生產(chǎn)能力最強(qiáng)，通過工程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。程措施，延長(zhǎng)此期，獲得高產(chǎn)。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。在第六期到來之前結(jié)束發(fā)酵。10青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為青霉素發(fā)酵過程中的代謝變化分為菌體生長(zhǎng)、青霉菌體生長(zhǎng)、青霉素合成和菌體自溶素合成和菌體自溶三個(gè)階段。三個(gè)階段。菌體生長(zhǎng)階段菌體生長(zhǎng)階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在合適的環(huán)境

6、中經(jīng)過短時(shí)間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、適的環(huán)境中經(jīng)過短時(shí)間的適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。生長(zhǎng)和繁殖，直至達(dá)到菌體的臨界濃度。青霉素合成階段青霉素合成階段：這個(gè)階段主要合成青霉素，：這個(gè)階段主要合成青霉素，青霉素的生產(chǎn)速率達(dá)到最大，并一直維持到青青霉素的生產(chǎn)速率達(dá)到最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強(qiáng)度一般無顯著變化。所增加，但產(chǎn)生菌的呼吸強(qiáng)度一般無顯著變化。菌體自溶階段菌體自溶階段：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率自溶，合成青

7、霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，下降，氨基氮增加，PHPH上升。上升。11絲狀菌三級(jí)絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工藝流程冷凍管（冷凍管（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，7 7天）天）斜面母瓶斜面母瓶（2525C C，孢子培養(yǎng)，孢子培養(yǎng)，7 7天）天）大米孢子（大米孢子（2626C C，種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)56h56h）一級(jí)種子培養(yǎng)液（一級(jí)種子培養(yǎng)液（2727C C，種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)，24h24h）二級(jí)種子培養(yǎng)液二級(jí)種子培養(yǎng)液（27262726C,C,發(fā)酵發(fā)酵,7,7天）天）發(fā)酵液。發(fā)酵液。12青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在合

8、適的培養(yǎng)基、合適的培養(yǎng)基、PHPH、溫度和通氣攪拌溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長(zhǎng)并合成青霉素。等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長(zhǎng)并合成青霉素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過前體和無機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過滅菌滅菌，后接入種子。，后接入種子。在整個(gè)過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐在整個(gè)過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑泡沫劑，假如酸，假如酸堿控制發(fā)酵液的堿控制發(fā)酵液的PHPH，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖，還需要間歇或連續(xù)的加入葡萄糖及銨

9、鹽等化合物以補(bǔ)充及銨鹽等化合物以補(bǔ)充碳源及氮源碳源及氮源，或補(bǔ)進(jìn)其他料液，或補(bǔ)進(jìn)其他料液和前體等以促進(jìn)青霉素的生產(chǎn)。和前體等以促進(jìn)青霉素的生產(chǎn)。13青霉素的發(fā)酵青霉素的發(fā)酵發(fā)酵工藝控制：發(fā)酵工藝控制：1.基質(zhì)濃度基質(zhì)濃度 2.培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基成分的控制 3.溫度溫度 4.pH 值、溶氧值、溶氧 5.菌絲狀態(tài)菌絲狀態(tài) 6.泡沫的控制泡沫的控制14發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制 1.基質(zhì)濃度基質(zhì)濃度：在發(fā)酵過程中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過在發(fā)酵過程中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制（如葡萄糖的阻遏和抑制抑制（如葡萄糖

10、的阻遏和抑制,苯乙酸的生長(zhǎng)抑苯乙酸的生長(zhǎng)抑制）制）,而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成成。所以，所以，在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法作法，以維持一定的最適濃度，以維持一定的最適濃度。15發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制2.培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基成分的控制:A.碳源：碳源：發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖。發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖。乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過一定限度時(shí)，會(huì)過萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過一定限度時(shí)，會(huì)過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶

11、解氧不能滿分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH下降，影響某些酶的活性，下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。從而抑制微生物的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流目前普遍采用淀粉的酶水解產(chǎn)物，葡萄糖化液流加，以降低成本。加，以降低成本。16發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制B.氮源：氮源：主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮

12、源，含固體量少，有利玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長(zhǎng)。無機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量生長(zhǎng)。無機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。使用。17發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制C.無機(jī)鹽：無機(jī)鹽：碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的液的pH值值 為菌體提供營(yíng)養(yǎng)的無機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。為菌體提供營(yíng)養(yǎng)的無機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所另外加入硫

13、代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。需的硫。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在含量在30ug/mL以下。現(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，以下?，F(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液；發(fā)酵時(shí)間愈長(zhǎng)，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液；發(fā)酵時(shí)間愈長(zhǎng)，則鐵離子愈多。鐵離子在則鐵離子愈多。鐵離子在50g/ml以上便會(huì)影響青霉素的以上便會(huì)影響青霉素的合成。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜。合成。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜。18發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制D.前體：前體：前體的加入是青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問

14、題之一。前體的加入是青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問題之一。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基轉(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度。的生產(chǎn)強(qiáng)度。但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇也有采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，

15、但價(jià)格較貴。前體要在發(fā)酵開始前體要在發(fā)酵開始20h后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過程中后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過程中控制在控制在50g/ml左右。前體用量大于左右。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素的生時(shí)，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。為宜。19發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制3.溫度溫度：青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別能稍有差別,但一般認(rèn)為應(yīng)在但一般認(rèn)為應(yīng)在25 C 左右。溫度過左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率,同時(shí)增加葡萄糖的維持同時(shí)增加葡萄糖的維

16、持消耗消耗,降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和青霉素合成來說長(zhǎng)和青霉素合成來說,最適溫度不是一樣的最適溫度不是一樣的,一般一般前者略高于后者前者略高于后者,故有的發(fā)酵過程在菌絲生長(zhǎng)階段故有的發(fā)酵過程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間,到達(dá)生產(chǎn)階段到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度后便適當(dāng)降低溫度,以利于青霉素的合成。以利于青霉素的合成。20發(fā)酵工藝控制發(fā)酵工藝控制4.pH 值、溶氧值、溶氧：pHpH值：青霉素發(fā)酵的最適值：青霉素發(fā)酵的最適pH pH 值一般認(rèn)為在值一般認(rèn)為在6.87.2 左右左右,應(yīng)盡量避免應(yīng)盡量避免 pH pH 值超過值超過7.07.0。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定件下不穩(wěn)定,容易加速其水解。容易加速其水解。溶氧溶氧:對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來說對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來說,溶氧濃度是影響發(fā)溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到酵過程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到30%30%飽和度以下飽和度以下時(shí)時(shí),青霉素產(chǎn)率急劇下降青霉素產(chǎn)率急劇下降,低于低于10%10%飽和度時(shí)飽