《流式細胞術在腫瘤學中的應用馬麗[5].ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《流式細胞術在腫瘤學中的應用馬麗[5].ppt（42頁珍藏版）》請在匯文網(wǎng)上搜索。

1、流式細胞術在腫瘤學中的應用貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室馬莉什么是流式細胞儀？（Flow Cytometer,FCM)在流動的狀態(tài)中檢測細胞各種物理及生物特征的一種儀器Injector TipFluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeamSheath fluid流式細胞術 流式細胞術是應用流式細胞儀對懸浮液中的細胞流式細胞術是應用流式細胞儀對懸浮液中的細胞或細胞器進行快速測量和多參數(shù)檢測的細胞分析或細胞器進行快速測量和多參數(shù)檢測的細胞分析技術，是上世紀技術，是上世紀7070年代在單細胞分析和分選基礎

2、年代在單細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞理化特性，諸如大小、上發(fā)展起來的對細胞理化特性，諸如大小、DNADNA、RNARNA、蛋白質、抗原等進行快速測量并分類收集、蛋白質、抗原等進行快速測量并分類收集的高科技技術。它綜合了激光技術，計算機技術，的高科技技術。它綜合了激光技術，計算機技術，流體力學，細胞化學，單克隆抗體，熒光化學，流體力學，細胞化學，單克隆抗體，熒光化學，分子生物學等各門學科，在對細胞群體的亞群進分子生物學等各門學科，在對細胞群體的亞群進行定量分析時，具有其它手段無法比擬的優(yōu)越性。行定量分析時，具有其它手段無法比擬的優(yōu)越性。流式細胞儀特點及檢測標本特異性強，靈敏度高，速度快，

3、并能實現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細針穿刺，洗脫液，實體組織，培養(yǎng)細胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細胞裂解液細胞周期及DNA倍體分析在臨床腫瘤中應用免疫指標檢測在臨床腫瘤中應用監(jiān)測癌基因與抗癌基因表達在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用監(jiān)測分析腫瘤多藥耐藥細胞凋亡流式細胞周期與流式細胞周期與DNA倍體分析的基本原理倍體分析的基本原理通過DNA檢測進行細胞周期分析細胞周期：G0、G1、S、G2、M細胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（二倍體）S期-2C 4C、G2/M-4C（四倍體）DNA熒光染料特異性與細胞DNA結合DNA含量的多少與熒光染料的結合量成正比，熒光強度與DNA所吸收

4、熒光分子多少成正比。最常用的熒光染料：碘化丙啶（PI）FCM分析細胞周期的基本方法DNA含量的表示細胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指數(shù)（DNA index，DI)表示相對含量，一個正常的二倍體細胞峰，其G0/G1期細胞DNA含量為2C，DI值為1.0。DI=（樣本G0/G1期細胞峰平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體標準細胞G0/G1期細胞峰平均熒光道數(shù)）DNA倍體的判定標準二倍體的DI為1.0，四倍體的DI為2.0。變異系數(shù)（CV）：標準細胞CV 3%，新鮮組織標本5%。DNA倍體判定標準，DNA非整倍體具有2個分離的G0/G1峰，并根據(jù)DI值判斷DNA倍體。對于一個正常人體的二倍體細胞群，

5、G0/G1期占85-90%以上，S+G2M細胞占10-15%以下。以二倍體參考細胞G0/G1期細胞DNA含量定為2C值DI=1.0，基于標準二倍體細胞的CV在5%以下，判定標準即；DNA二倍體=2C+2CV，DNA異倍體不等于2C+2CV。1.DI=1.0 0.1(0.91.10)為二倍體。2.DI=1.0 0.15(0.851.15)為近二倍體。3.DI=2.0 0.1(1.902.10)為四倍體。4.DI 2.10為多倍體5.其余DI均為異倍體。流式細胞周期與DNA倍體的分析方法（一）單細胞懸液制備1、新鮮或冰凍實體組織：酶消化法、機械法、化學試劑處理法等。剪碎法：取新鮮或冰凍（浸泡于生理

6、鹽水中）實體組織0.5cm3，眼科手術剪剪碎，加入生理鹽水，300目尼龍膜過濾，200g離心5min，生理鹽水洗滌二次。半自動機械法單細胞制備系統(tǒng)：是目前較為理想的方法，簡便，實用，單細胞獲取率較高，特別適用于臨床應用。由于各種實體組織成份、特性各不相同，對不同的實體組織必須采用不同的單細胞分散方法，才能使單細胞產(chǎn)量高，細胞損傷小。新鮮組織單細胞懸液制備注意事項：手術或活檢的新鮮組織及時浸泡于生理鹽水。立即送檢 冷凍或冷藏。（室溫過高，放置時間過長而造成組織自溶發(fā)生，影響檢測結果）2、石蠟包埋組織：擴大了FCM分析應用范圍，并可以對大量臨床隨訪病例資料進行重新研究與利用。標體制備：二甲苯脫蠟法

7、組織清潔劑脫蠟法甲酸雙氧水處理法。注意事項：脫蠟完全：檢驗方法 加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，即可視為脫凈，反之則沒有脫凈。掌握消化時間，避免細胞核消化掉。切片薄厚適宜，過薄碎片大多，過厚不宜脫蠟。3、骨髓、血液及體液：去除紅細胞及濃縮有核細胞。骨髓及血液：淋巴細胞分離液體液：一般需經(jīng)300g離心5min，PBS洗滌二次。如體液中紅細胞太多，可用溶血素去除紅細胞。注意事項：每次同時制備對照血液淋巴細胞標本，作為二倍體細胞外參標準。視標本中有核細胞濃度的高低進行調整，一般細胞濃度調至510*109/L。（二）DNA染色及FCM分析1、PI染色法應用BD公司Cycle TEST IMK Ki

8、t（1）單細胞懸液制備（2）加入A液250ul，放置10分鐘。（3）加入B液200ul，放置10分鐘。（4）加入冷C液200ul，避光放入2-8C冰箱10分鐘。置28C冰箱避光保存，4h內FCM檢測（5）流式細胞分析：流式細胞儀校準與設置、數(shù)據(jù)獲取用Cellquest軟件，SSC/FSC、FL2設置為線性放大，閾值設為FL2。收集圖：FSC/SSC和FL2W/FL2A散點圖、FL2-H或FL2-A熒光直方圖 數(shù)據(jù)分析：ModFit軟件 流式細胞周期與DNA倍體分析在臨床腫瘤學中應用FCM分析在腫瘤早期診斷和監(jiān)別診斷中的應用DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志，有助于癌變的早期診斷。淋巴瘤在病

9、理形態(tài)學還不能作出診斷前，F(xiàn)CM倍體分析可以提供準確的診斷信息。DNA非整倍體的交界瘤應按惡性腫瘤對待。形態(tài)學表現(xiàn)為良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示有惡變的可能。DI可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標FCM分析DNA含量和DNA倍體的預后意義通常認為DNA含量高，非整倍體的腫瘤惡性程度高，預后差，二倍體或近二倍體腫瘤預后好。除DI及倍體外，反映腫瘤細胞增殖狀態(tài)的S期細胞比例也被作為判斷預后的指標。FCM分析在腫瘤脫落細胞學檢查中的應用FCM分析診斷腫瘤細胞的標準：(1)發(fā)現(xiàn)DNA非整倍體細胞峰診斷為癌。(2)如無明顯的非整倍體細胞峰，但有一個突出的四倍體細胞峰和15%的超二倍體細胞（S期細胞），并伴有G0/G1峰的CV 9%，診斷為癌。(3)無明顯的非整倍體細胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有10%15%超二倍體細胞和一個突出的四倍體峰，診斷為可疑癌。