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1、 骨組織石蠟切片制作步驟：1.固定：切取骨缺損出的骨組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛緩沖液內(nèi)固定1224h。2.脫鈣：將固定好的骨組織放入脫鈣液中侵泡脫鈣24h.3.脫水：將固定好的骨組織用蒸餾水沖洗3次，再用50%的酒精沖洗2 次，常規(guī)脫水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精I(xiàn)I（25min）。4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。5.包埋：將透明處理后的骨組織依次侵入石蠟I 1小時，石蠟II 1小時。6.切片：包埋后的組織塊經(jīng)修理后，用切片機切成4um的石蠟帶，將組織石蠟塊在50

2、溫水中展片，然后用干凈的載玻片撈片。7.烤片：將切好的組織片放入63恒溫箱中烤片2小時。 免疫組化檢測步驟：1.脫蠟：將組織切片放入62恒溫箱中烘烤20min 二甲苯1（10min） 二甲苯2（10min）。2.水化：100%酒精1（2min） 100%酒精（2min） 95%酒精（2min） 80%酒精（2min） 70%酒精(2min) 。3.PBS沖洗3次，每次5min.。4.抗原修復(fù)：將組織片置0.01M的檸檬酸緩沖液（PH6.0）中煮沸15min ,自然冷卻至室溫。5.PBS沖洗3次，每次5min。6.阻斷：3%去離子水37孵育10min,以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。7.PBS沖洗3

3、次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP 1：100稀釋, 4過夜） 9.PBS沖洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫組化檢測試劑的試劑1，37孵育,20min, PBS沖洗3次，每次5min。 11. 滴加二步法免疫組化檢測試劑的試劑2，37孵育,20min, PBS沖洗3次，每次5min。 12.DAB顯色5min。 13.自來水沖洗10min。 14.蘇木精復(fù)染2min,鹽酸酒精分化。 15.自來水沖洗10min。 16.常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。組織切片HE染色步驟1、將烘烤后的組織切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II進行脫蠟各10min。2、脫蠟后的組織切片依次浸入無水乙醇I、無水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2 min，PBS沖洗2次，每次5min。3、蘇木素染色3 min, 自來水沖洗3 min, 1 %鹽酸酒精分色2 s，自來水沖洗2 min, 依次浸入50 %、70 %、80 %的酒精中各2 min,伊紅浸泡5 s，自來水沖洗3min。4、 再將組織切片依次侵入95 %酒精、無水乙醇I、無水乙醇II中各3min，最后再依次侵入二甲苯I,二甲苯II各5min。5.中性樹膠封片，鏡檢。