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1、生物技術(shù)實(shí)踐,（2）按培養(yǎng)基的物理形態(tài)分： 液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基,一 培養(yǎng)基:,（3）按培養(yǎng)基的功能分： 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,（1）按培養(yǎng)基的化學(xué)成分分： 天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 半合成培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌 加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌 不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌 不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物 加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基: 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞 加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基: 分離雜交瘤細(xì)胞,各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都包括哪些成分？ 不管哪種培養(yǎng)

2、基，一般都含有水、碳源、和氮源、 無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 注： 另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。,(1)無(wú)菌技術(shù)具體操作 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒。 將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。 為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。,二 無(wú)菌技術(shù)：無(wú)菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min

3、 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源 4、紫外線消毒 ,(2)常用消毒的方法：,1、灼燒滅菌: 2、干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。 3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 下維持15-30min.,(3)常用滅菌的方法：,(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。,三、實(shí)驗(yàn)操作,純化大腸桿菌以及菌種的保藏,滅菌: 將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121，滅菌1530min。

4、將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160170 下滅菌2h。 倒平板: 待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。2d后觀察平板，無(wú)雜菌污染才可用來(lái)接種.,倒平板:,1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？,問(wèn)題討論,答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。,2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？,答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,注意:,3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？,4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生

5、物嗎？為什么？,答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。,(2)純化大腸桿菌 原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個(gè)細(xì)胞，使其長(zhǎng)成單個(gè)的菌落，這個(gè)菌落就是一個(gè)純化的細(xì)菌菌落。 方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法。,平板劃線法:通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面. 在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.

6、,劃線后 培養(yǎng)一段時(shí)間后,微生物的恒溫培養(yǎng),問(wèn)題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3

7、.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。,問(wèn)題討論,涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？,應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。,(3)菌種的保存,1、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于4冰箱保存。 2、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法,一、土壤中

8、分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 1選擇合適的培養(yǎng)基 (1)根據(jù)培養(yǎng)基的用途可分為選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基,(2)分離分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基即為選擇培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的氮源只有尿素，理論上只有能合成脲酶的微生物才能在上面生長(zhǎng)。,分離分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基，其配方如下：,2統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的方法 (1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 原理：利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物數(shù)量。 方法：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。 缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。 (2)間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法) 原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)著一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品

9、中大約含有多少活菌。,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,常用稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。為保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)30300的平板計(jì)數(shù)。,操作 a設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。 b為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。 計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)C/VM，其中C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。 3細(xì)菌分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)流程 土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物培養(yǎng)觀察并記錄結(jié)果

10、細(xì)菌計(jì)數(shù)。,二、分解纖維素的微生物的分離 1纖維素酶 是一種復(fù)合酶，它包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。 2纖維素分解菌的篩選原理 (1)剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 (2)纖維素分解菌能增生纖維素酶分解纖維素，從而使菌落周圍形成透明圈。,3土壤中纖維素分解菌的篩選 (1)方案 土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。 (2)選擇培養(yǎng)的目的：增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。 (3)涉及的微生物技術(shù)主要有：培養(yǎng)

11、基的制作、無(wú)菌操作、稀釋涂布平板法、選擇培養(yǎng)基的作用、土壤取樣等。,【例1】從自然菌樣篩選較理想的生產(chǎn)菌種的一般步驟是：采集菌樣 富集培養(yǎng)純種分離性能測(cè)定。 (1)不同微生物的生存環(huán)境不同，獲得理想微生物的第一步是從適合 的環(huán)境采集菌樣，然后再按一定的方法分離、純化。培養(yǎng)嗜鹽菌的 菌樣應(yīng)從_環(huán)境采集。 (2)富集培養(yǎng)指創(chuàng)設(shè)僅適合待分離微生物旺盛生長(zhǎng)的特定環(huán)境條件， 使其在群落中的數(shù)量大大增加，從而分離出所需微生物的培養(yǎng)方 法。對(duì)產(chǎn)耐高溫淀粉酶微生物的富集培養(yǎng)應(yīng)選擇_ 的培養(yǎng)基，并在_條件下培養(yǎng)。,海灘等高鹽,以淀粉為唯一碳源,高溫,(3)下面兩圖是采用純化微生物培養(yǎng)的兩種接種方法接種后培養(yǎng)的效

12、果圖解，請(qǐng)分析接種的具體方法。 獲得圖A效果的接種方法是_，獲得圖B效果的接種方法是_。 (4)配制培養(yǎng)基時(shí)各種成分在溶化后分裝前必須進(jìn)行_，接種前要進(jìn)行_，在整個(gè)微生物的分離和培養(yǎng)中，一定要注意在_條件下進(jìn)行。,稀釋涂布平板法,平板劃線法,pH調(diào)整,高壓蒸汽滅菌,無(wú)菌,2(2009寧夏理綜，40)(1)在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，除考慮營(yíng)養(yǎng)條件 外，還要考慮_、_和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具 有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異類型容易選擇、_、_ 等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。 (2)在微生物培養(yǎng)操作過(guò)程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng) 器皿進(jìn)行_(消毒、滅菌)；操作者的雙手需進(jìn)行清洗和_；

13、靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線殺滅，其原因是紫外線能使蛋白質(zhì)變 性，還能_。 (3)若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì) 值更接近實(shí)際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測(cè)樣品 稀釋的_。,溫度,酸堿度,易培養(yǎng),生活周期短,滅菌,消毒,損傷DNA的結(jié)構(gòu),比例合適,(4)通常，對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對(duì)細(xì) 菌進(jìn)行初步的_。 (5)培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于固體培 養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是_ _。 (6)若用大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用過(guò)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)物必須經(jīng)過(guò)_ 處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。,鑒定(或分類),將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時(shí)間，觀察培養(yǎng)基上是 否有菌落產(chǎn)生,滅菌,