實(shí)驗(yàn)40植物組織中過氧化氫含量及過氧化氫酶活性測定 實(shí)驗(yàn)40 植物組織中過氧化氫含量及過氧化氫酶活性測定 ? 植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積.H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除H2O2，是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一。因此，植物組織中H2O2含量和過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用分光光度法測定過氧化氫含量,利用高錳酸鉀滴定法和紫外吸收法測定過氧化氫酶活性。 一、過氧化氫含量的測定 【原理】 H2O2與硫酸鈦（或氯化鈦）生成過氧化物-鈦復(fù)合物黃色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波長下比色測定。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與H2O2濃度呈線性關(guān)系。 【儀器和用具】 研缽;移液管0。2ml×2支，5ml×1支;容量瓶10ml×7個(gè),離心管5ml×8支;離心機(jī)；分光光度計(jì)。 【試劑】 100μmol/L H2O2丙酮試劑：取30％分析純H2O2 57μl，溶于100ml，再稀釋100倍；2mol/L硫酸；5％(W/V)硫酸鈦；丙酮;濃氨水。 【方法】 1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：取10ml離心管7支，順序編號,并按表40-1加入試劑。 表40-1 測定H2O2濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線配置表 試劑(ml） 離 心 管 號 1 2 3 4 5 6 7 100μmol/L H2O2 0 0.1 0.2 0。4 0。6 0。8 1。0 4℃下預(yù)冷丙酮 1.0 0。9 0。8 0.6 0。4 0.2 0 5％硫酸鈦 0.1 0.1 0。1 0。1 0.1 0.1 0。1 濃氨水 0。2 0。2 0.2 0.2 0。2 0.2 0。2 ? 3000r/min 離心10min，棄去上清夜，留沉淀 2mol 硫酸 5。0 5.0 5。0 5。0 5.0 5.0 5。0 待沉淀完全溶解后,將其小心轉(zhuǎn)入10ml容量瓶中，并用蒸餾水少量多次沖洗離心管，將洗滌液合并后定容至10ml刻度，415nm波長下比色。 2.樣品提取和測定：（1）稱取新鮮植物組織2~5g（視H2O2含量多少而定）,按材料與提取劑1∶1的比例加入4℃下預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入離心管3000 r/min下離心10min，棄去殘?jiān)?，上清液即為樣品提取?(2)用移液管吸取樣品提取液1ml,按表35—1加入5％硫酸鈦和濃氨水，待沉淀形成后3000rpm/min離心10min，棄去上清液。沉淀用丙酮反復(fù)洗滌3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗滌后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,與標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法定容并比色。 3。結(jié)果計(jì)算： 植物組織中H2O2含量(μmol/g Fw）= 式中 C-標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中H2O2濃度(μmol）； Vt—樣品提取液總體積(ml）； V1-測定時(shí)用樣品提取液體積（ml)； FW—植物組織鮮重（g)。 二、過氧化氫酶的活性測定-—高錳酸鉀滴定法 【原理】 過氧化氫酶（CAT)屬于血紅蛋白酶，含有鐵，它能催化過氧化氫分解為水和分子氧，在此過程中起傳遞電子的作用，過氧化氫則既是氧化劑又是還原劑。 2e－ ? ? R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) 2e－ ? ? R(Fe+3OH－）2+H2O2==R（Fe+2）2+2H2O+O2 據(jù)此，可根據(jù)H2O2的消耗量或O2的生成量測定該酶活力大小。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入一定量（反應(yīng)過量）的H2O2溶液,經(jīng)酶促反應(yīng)后，用標(biāo)準(zhǔn)高錳酸鉀溶液（在酸性條件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【儀器和用具】 研缽；三角瓶50ml×4;酸式滴定管（10ml）;恒溫水浴;容量瓶25ml×1. 【試劑】 10% H2SO4;0.2mol/L磷酸緩沖液pH7。8； 0。1mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液：稱取KMnO4（AR）3。1605g,用新煮沸冷卻蒸餾水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定； 0.1mol/L H2O2:市售30% H2O2大約等于17.6mol/L，取30％ H2O2溶液5。68ml,稀釋至1000ml，用標(biāo)準(zhǔn)0。1mol/ KMnO4溶液(在酸性條件下）進(jìn)行標(biāo)定； 0.1mol/L草酸:稱取優(yōu)級純H2C2O4 ·2H2O 12.607g，用蒸餾水溶解后，定容至1L。 【方法】 1。酶液提取 取小麥葉片2.5g加入pH7。8的磷酸緩沖溶液少量，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中，用該緩沖液沖洗研缽,并將沖洗液轉(zhuǎn)入容量瓶中,用同一緩沖液定容，4000rpm離心15min，上清液即為過氧化氫酶的粗提液。 2。取50ml三角瓶4個(gè)（兩個(gè)測定兩個(gè)對照),測定瓶中加入酶液2。5ml，對照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2。5ml 0.1mol/L H2O2，同時(shí)計(jì)時(shí),于30℃恒溫水浴中保溫10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 3。用0.1mol/L KMnＯ4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定H2O2,至出現(xiàn)粉紅色(在30min內(nèi)不消失）為終點(diǎn). 4。結(jié)果計(jì)算： 酶活性用每克鮮重樣品1min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示： 酶活(mgH2O2/gFW·min)= 式中 A—對照KMnO4滴定毫升數(shù)； B—酶反應(yīng)后KMnO4滴定毫升數(shù)； VT—酶液總量(ml); V1—反應(yīng)所用酶液量(ml）； W—樣品鮮重（g); 1。7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相當(dāng)于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液臨用前要經(jīng)過重新標(biāo)定. 三、過氧化氫酶的活性測定-—紫外吸收法 【原理】 H2O2在240nm波長下有強(qiáng)烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應(yīng)溶液吸光度（A240)隨反應(yīng)時(shí)間而降低。根據(jù)測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。 【儀器與用具】 紫外分光光度計(jì)；離心機(jī)；研缽;250ml容量瓶1個(gè)；0。5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水?。? 【試劑】 0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮）; 0。1mol/L H2O2（用0。1mol/L高錳酸鉀標(biāo)定)。 【方法】 1。酶液提取:稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml 4℃下預(yù)冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度.混合均勻?qū)⒘科恐?℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min,上清液即為過氧化氫酶粗提液.5℃下保存?zhèn)溆? 2.測定:取10ml試管3支,其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40—2順序加入試劑。 表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表 管 號 S1 S2 S3 粗酶液（ml） 0。0 0。2 0。2 pH7.8磷酸(ml） 1.5 1.5 1.5 蒸餾水(ml） 1。0 1.0 1。0 25℃預(yù)熱后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計(jì)算酶活性。 3.結(jié)果計(jì)算： 以1min內(nèi)A240減少0。1的酶量為1個(gè)酶活單位（u). 過氧化氫酶活性(u/gFW/min)= 式中 A240 = AS0－ AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值； AS1， AS2—樣品管吸光值； Vt—粗酶提取液總體積(ml）; V1—測定用粗酶液體積（ml)； FW—樣品鮮重（g）; 0.1—A240每下降0。1為1個(gè)酶活單位（u); t-加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時(shí)間(min)。 【注意事項(xiàng)】 凡在240nm下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)對本實(shí)驗(yàn)有干擾。 【思考題】 1.影響過氧化氫酶活性測定的因素有哪些? 2.過氧化氫酶與哪些生化過程有關(guān)? ?