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1、實(shí)驗(yàn)八 土壤微生物的分離和純化一、目的 1了解從土壤中分離與純化微生物的基本原理及方法。 2掌握幾種常用的分離的基本操作技術(shù)。二、原理 在自然界中，土壤是微生物生活中的最適宜的環(huán)境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，因此，為了研究某一微生物的特性，或者要大量地培養(yǎng)和利用某種微生物，必須把它們從這些混雜的微生物群中分離出來。從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。這種獲得純培養(yǎng)的方法稱之為微生物的分離和純化三、器材 1牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏l號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。 2盛有100毫升無菌水的三角瓶，9毫升無菌水的試管，無菌吸管，無菌玻璃涂抹棒，10的酚液，25

2、的乳酸，土樣，接種環(huán)，標(biāo)簽。四、方法(一)涂抹平板分離法1制備土壤稀釋液 稱取土樣10克，放入裝有玻璃珠和100毫升無菌水的三角瓶中，振搖1520分鐘，使土與水充分混合，將菌分散，靜止片刻，用吸管從中吸取1毫升土壤懸液注人盛有9毫升無菌水試管中，吹吸三次，并振搖使之充分混勻，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5的各種稀釋度的土壤懸液。2倒平板 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏1號(hào)培養(yǎng)基，馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基溶化。待冷至5060時(shí)，在高氏l號(hào)培養(yǎng)基中加入10酚2滴，在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基中加入25乳酸2滴，然后分別倒平板，每支培養(yǎng)基倒

3、一皿(用右手持盛培養(yǎng)基的試管，左手撥出棉花塞，試管口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿在火焰附近打開少許，迅速注入培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基均勻分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。(見圖18)。 3涂抹 將上述每種培養(yǎng)基平板標(biāo)上10-3、10-4、10-5稀釋度，然后用無菌吸管分別從10-5、10-4、10-3稀釋度的試管中吸取土壤懸液，每一平板注入0.2毫升，再用滅菌玻璃涂抹刮棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，靜止5分鐘。 4培養(yǎng) 將培養(yǎng)皿倒置，放在28溫箱培養(yǎng)。5移接 將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落分別移接到三種斜面培養(yǎng)基上，28下培養(yǎng)，待菌苔長出后檢查菌苔是否純，若有其他雜菌，要進(jìn)一步進(jìn)行分離

4、純化，直到獲得純培養(yǎng)，整個(gè)分離過程(見圖19)。 圖17 接種工具 圖18 倒平板圖19 從土壤分離微生物的操作過程 (二)平板劃線分離法1倒平板：按上述三種培養(yǎng)基各倒一平板、冷凝。2劃線：右手拿接種環(huán)，從上述10-1的土壤懸液中取一環(huán)，左手托培養(yǎng)皿，并在火焰附近打開蓋少許，在培養(yǎng)基平板表面輕輕劃線，劃線方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品進(jìn)一步在平板上稀釋分散，使形成單獨(dú)的菌落。劃線的方法（如圖20），具體方法如下： (1)取一環(huán)菌樣先在平板上劃平行線至一半，然后將接種環(huán)上剩余菌燒死，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)90角，通過第一次平行線劃線，劃完后蓋上皿蓋，倒置培養(yǎng)。(2)取一環(huán)菌樣后先在平

5、板上作幾條平行線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)70角。，把接種環(huán)上剩余的菌燒死，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行線，再用同法通過第二次平行線作第三次；第四次平行線。劃完畢后，蓋上皿蓋，倒置培養(yǎng)。圖20 劃線分離方法五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果10-5濃度細(xì)菌放線菌酵母菌霉菌PDA72132高氏一號(hào)1761NA42132六、思考與討論13-5天后統(tǒng)計(jì)3種培養(yǎng)基平板上長出的菌落數(shù)，確定最佳稀釋濃度。初步判別各培養(yǎng)基上長出的菌落屬于分別哪個(gè)類群？簡述它們的菌落形態(tài)特征。 最佳的稀釋濃度為10-5培養(yǎng)基長出的菌落分為：放線菌，細(xì)菌，酵母菌，霉菌四大類。放線菌的形態(tài)特征為干燥，小而緊密，顏色多樣。細(xì)菌的特點(diǎn)是濕，小而突起或大而

6、平坦。酵母菌的特點(diǎn)是較濕，菌落大而突起。霉菌的特點(diǎn)是干燥，菌落大。2劃線分離時(shí)，為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉？劃線為何不能重疊？ 將接種環(huán)上多余的菌體燒掉是為了為了防止雜菌污染,提高培養(yǎng)純度。劃線分離的目的就是為了分理出單一的菌種，只有通過不斷稀釋劃線才能夠分離出，如果重疊的話就不能把單一的菌體從多種菌體中分離出來。3培養(yǎng)時(shí)為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？ 防止冷凝水滴下沖壞自然形成的菌落，影響觀察。拿出觀察時(shí)方便，防止平皿底滑落。防止雜菌落入。4.在倒完平板之后一定要等待一段時(shí)間，等培養(yǎng)基冷卻下來，凝固好之后再進(jìn)行涂布平板以及劃線，否則涂布平板以及劃線的操作會(huì)把培養(yǎng)基弄破，影響最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。5.涂布平板和劃線時(shí)都要注意衛(wèi)生，事先都要進(jìn)行高溫滅菌處理，否則會(huì)造成其他細(xì)菌的污染。6.剛開始倒平板的時(shí)候手可能會(huì)有些發(fā)抖，多練習(xí)幾次就好很多了。