《線蟲實(shí)驗(yàn)11課件.ppt》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《線蟲實(shí)驗(yàn)11課件.ppt（52頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)趨R文網(wǎng)上搜索。

1、線蟲實(shí)驗(yàn)線蟲實(shí)驗(yàn)1開設(shè)線蟲有關(guān)實(shí)驗(yàn)的目的意義開設(shè)線蟲有關(guān)實(shí)驗(yàn)的目的意義n線蟲作為模式生物，與酵母、果蠅、斑馬魚、線蟲作為模式生物，與酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠和擬南芥等一起，為生命科學(xué)的發(fā)展做出小鼠和擬南芥等一起，為生命科學(xué)的發(fā)展做出了極大的貢獻(xiàn)。了極大的貢獻(xiàn)。n目前，國(guó)內(nèi)外眾多的科研機(jī)構(gòu)都在以線蟲作為目前，國(guó)內(nèi)外眾多的科研機(jī)構(gòu)都在以線蟲作為研究材料，在研究材料，在RNAi、衰老、藥物篩選、功能、衰老、藥物篩選、功能基因組學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行研究基因組學(xué)等領(lǐng)域進(jìn)行研究n北京生命科學(xué)研究所北京生命科學(xué)研究所、遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究、遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、北京大學(xué)所、北京大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

2、、東南大學(xué)東南大學(xué)等單位等單位22002諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)nBrenner,Horvitz&Sulstonn n“For their discoveries concerning genetic regulation of organ development and programmed cell death.”32006諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)nfor their discovery of RNA interference-gene silencing by double-stranded RNAAndrew Z.Fire Craig C.Mello Fire A,et al.Potent and s

3、pecific genetic interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998,391:806-81142008諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)for the discovery and development of the green fluorescent protein,GFPMartin ChalfieColumbia University New York,USA 5Expression of GFP from a first stage C.elegans larva(Chalfie et al.,19

4、94).nThe two touch receptor neurons ALMR and PLMR are fluorescence-labelled at their cell bodies,leading to the strongly fluorescing two dots in the figure.Fluorescing processes can be seen projecting from both of these cell bodies.Halos produced from the out-of-focus of homologues of these cells on

5、 the other side of the animal are indicated by arrow heads.The thick arrow points to the nerve ring branch from the ALMR cell(out of focus);the thin arrows point to weakly fluorescing cell bodies.6Postdoctoral position,Vatamaniuk Lab,Cornell nA postdoctoral position is available in a young research

6、group at Cornell University to study genetic and biochemical interactions of ATP-bindings cassette(ABC)transporters and the molecular mechanisms of their function in detoxification of heavy metals.We seek highly motivated,responsible,and talented individuals with extensive experience in molecular ge

7、netics and at least some basic experience in protein biochemistry.Experience with C.elegans work is desirable.Interested applicants should send a CV and the names and contact information of 3 persons who can provide a letters of reference.Please send information by email to okv2cornell.edu.7實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

8、線蟲的生物學(xué)線蟲的生物學(xué)8線蟲的生物學(xué)線蟲的生物學(xué)n通常所說(shuō)的線蟲特指秀麗隱桿線蟲通常所說(shuō)的線蟲特指秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis Caenorhabditis eleganselegans)是一種很小的蠕蟲。是一種很小的蠕蟲。n秀麗隱桿線蟲成體長(zhǎng)僅秀麗隱桿線蟲成體長(zhǎng)僅1mm1mm，全身透明，以細(xì)菌為食，全身透明，以細(xì)菌為食，居住在土壤中，全身共有居住在土壤中，全身共有959959個(gè)細(xì)胞。個(gè)細(xì)胞。n線蟲整個(gè)的生命周期僅線蟲整個(gè)的生命周期僅3 3天（天（2525）。野生型線蟲胚胎）。野生型線蟲胚胎發(fā)育中細(xì)胞分裂和細(xì)胞系的形成具有高度的程序性，發(fā)育中細(xì)胞分裂和細(xì)胞系的形成具有高度的程序

9、性，這樣就便于對(duì)其發(fā)育進(jìn)行遺傳學(xué)分析。這樣就便于對(duì)其發(fā)育進(jìn)行遺傳學(xué)分析。9線蟲的生物學(xué)線蟲的生物學(xué)n秀麗隱桿線蟲有秀麗隱桿線蟲有5 5對(duì)常染色體和對(duì)常染色體和1 1對(duì)性染色體；性別為對(duì)性染色體；性別為雌雄同體或雄性（自然群體中為千分之一）；雌雄同體或雄性（自然群體中為千分之一）；n雜交時(shí)，后代雌雄比例為雜交時(shí)，后代雌雄比例為1 1：1 1n成蟲一生可產(chǎn)成蟲一生可產(chǎn)300300個(gè)受精卵；個(gè)受精卵；n有大量突變株；有大量突變株；n可以用可以用-80-80冰箱長(zhǎng)期保存冰箱長(zhǎng)期保存n線蟲基因組測(cè)序線蟲基因組測(cè)序19981998年完成年完成10Life cycle of C.elegansntemper

10、ature-dependentn15,5.5day;n20,3.5day;n25,2.5day 11線蟲的發(fā)育線蟲的發(fā)育12線蟲的發(fā)育線蟲的發(fā)育13.GGTATCCATTAGGTAT?1-dimensional genetic information100,281,416 bp 20,000 genes1 cell at fertilization to 959/1031 cells in adult4-dimensional processes of development14線蟲的性別線蟲的性別n雌雄同體雌雄同體n雄性雄性15線蟲的突變體（一）線蟲的突變體（一）a:wild type b:

11、dummpy c:small d:long16線蟲的突變體（二）線蟲的突變體（二）n運(yùn)動(dòng)類型突變運(yùn)動(dòng)類型突變1718實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎學(xué)會(huì)線蟲的飼養(yǎng)技術(shù)；學(xué)會(huì)線蟲的飼養(yǎng)技術(shù)；n觀察線蟲的形態(tài)特征；觀察線蟲的形態(tài)特征；19實(shí)驗(yàn)安排實(shí)驗(yàn)安排n時(shí)間安排：時(shí)間安排：n本周準(zhǔn)備各種材料，觀察并接種培養(yǎng)本周準(zhǔn)備各種材料，觀察并接種培養(yǎng)n下周下周“細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與觀察細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)與觀察”n再下周再下周“環(huán)境因素對(duì)線蟲基因表達(dá)的影響環(huán)境因素對(duì)線蟲基因表達(dá)的影響”n分組安排：分組安排：n按按4-8人為一小組人為一小組 20實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n準(zhǔn)備線蟲培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)所需要的培養(yǎng)基、準(zhǔn)備線蟲培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)所需要的培養(yǎng)基、試劑等

12、試劑等n大腸桿菌大腸桿菌OP50的培養(yǎng)的培養(yǎng)nLB液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 【200ml】2g蛋白胨蛋白胨,1 g 酵母粉酵母粉,1 g NaCL,加水至加水至200ml121實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n1M MgSO4溶液溶液【100ml】n1MCaCl2溶液溶液 【100ml】n1M磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液【200ml】（配方：108.3gKH2PO4，35.6gK2HPO4，加水至加水至1L）234滅菌滅菌22實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n線蟲培養(yǎng)基線蟲培養(yǎng)基 【1000ml】n17g瓊脂、瓊脂、3gNaCl、2.5g peptone，加入，加入蒸餾水（自來(lái)水亦可）蒸餾水（自來(lái)水亦可）987ml n滅菌后加入：滅

13、菌后加入：n5mg/ml膽固醇膽固醇1.0ml n25ml 1M磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液n1ml MgSO4n1ml CaCl2 523實(shí)驗(yàn)內(nèi)容nM9 緩沖液緩沖液【500ml】n1.5g KH2PO4,3gNa2HPO4,2.5gNaCl,加水到加水到500mLn滅菌后加滅菌后加0.5ml 1M MgSO4 624實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容nK medium【200ml】n52mM NaCl，32mM KCln滅菌并倒平板滅菌并倒平板7825實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容n每組每組n培養(yǎng)皿包扎、滅菌培養(yǎng)皿包扎、滅菌n觀察觀察n接種野生型和轉(zhuǎn)基因品系各接種野生型和轉(zhuǎn)基因品系各1皿皿26實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)要求n小組內(nèi)的充分討

14、論小組內(nèi)的充分討論n各小組間的配合各小組間的配合n提問提問27作業(yè)作業(yè)n查找線蟲的資料查找線蟲的資料28重金屬誘導(dǎo)的線蟲細(xì)胞凋亡重金屬誘導(dǎo)的線蟲細(xì)胞凋亡29實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎了解線蟲同步化培養(yǎng)的技術(shù)了解線蟲同步化培養(yǎng)的技術(shù)n了解熒光顯微鏡的使用了解熒光顯微鏡的使用n學(xué)習(xí)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究基本技術(shù)，鞏學(xué)習(xí)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究基本技術(shù)，鞏固理論知識(shí)固理論知識(shí)30原理原理n細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指細(xì)胞在一定的是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制的生理或病理?xiàng)l件下，受內(nèi)在遺傳機(jī)制的控制自動(dòng)結(jié)束生命的過程?？刂谱詣?dòng)結(jié)束生命的過程。n蝌蚪變態(tài)時(shí)，尾部細(xì)胞退化也是一種程蝌蚪變態(tài)時(shí)

15、，尾部細(xì)胞退化也是一種程序性死亡序性死亡 31原理原理n凋亡細(xì)胞核表現(xiàn)為染色增強(qiáng)、熒光更為凋亡細(xì)胞核表現(xiàn)為染色增強(qiáng)、熒光更為明亮，呈圓形、固縮狀或團(tuán)塊狀；明亮，呈圓形、固縮狀或團(tuán)塊狀；n非凋亡細(xì)胞核呈正常形態(tài)，熒光深淺不非凋亡細(xì)胞核呈正常形態(tài)，熒光深淺不一；一；n熒光染料染色后，在熒光顯微鏡下清晰熒光染料染色后，在熒光顯微鏡下清晰可辨?？杀妗?2凋亡細(xì)胞的核固縮，更亮凋亡細(xì)胞的核固縮，更亮33原理原理n重金屬如鎘、銅等處理能引起線蟲的細(xì)重金屬如鎘、銅等處理能引起線蟲的細(xì)胞凋亡胞凋亡n吖啶橙能透過細(xì)胞膜，嵌入細(xì)胞核吖啶橙能透過細(xì)胞膜，嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光，使之發(fā)出明亮的綠色熒

16、光34實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作n線蟲的培養(yǎng)線蟲的培養(yǎng)nOP50接種于接種于LB液體中，液體中，37培養(yǎng)培養(yǎng)12-24hr；n倒倒NGM平板，涂平板，涂OP50菌液菌液200微升，培養(yǎng)過微升，培養(yǎng)過夜備用夜備用n挖取一小塊帶有線蟲的瓊脂，接種；挖取一小塊帶有線蟲的瓊脂，接種；n或用或用M9緩沖液洗下線蟲，接種到緩沖液洗下線蟲，接種到NGM平板平板n20培養(yǎng)培養(yǎng)35實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作n同步化同步化n懷卵成蟲用懷卵成蟲用3mlM9洗下，放入洗下，放入5ml的塑料試管，加入的塑料試管，加入0.8ml20%次氯酸鈉，次氯酸鈉，0.4ml0.5M的的NaOHn處理處理10min，觀察，蟲體破裂，觀察，蟲體破裂n5500轉(zhuǎn)離心轉(zhuǎn)離心1min，棄上清，棄上清n4mlM9洗滌洗滌2次次n加入加入4mlM9，混勻，混勻n轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，20孵化孵化24hrn離心離心5500轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)1min，吸取上清棄去，留，吸取上清棄去，留300-400微升微升n混勻后，接種于混勻后，接種于NGM上，上，20培養(yǎng)，約培養(yǎng)，約64hr達(dá)早期達(dá)早期成蟲成蟲36實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作n細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)觀察細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)觀察nM9洗下，離心，