細(xì)胞生物學(xué)技術(shù):7流式細(xì)胞術(shù)---原理、操作及應(yīng)用課件.pptx
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1、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) -原理、操作及應(yīng)用原理、操作及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理一、流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)和原理流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞儀的光信號檢測流式細(xì)胞儀的光信號檢測流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成熒光抗體的選擇熒光抗體的選擇流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存貯、顯示與分析二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧二、流式細(xì)胞術(shù)操作與技巧三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用三、流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1.1 流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)簡介流式細(xì)胞術(shù)(流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,F(xiàn)CM)是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項(xiàng)能快速、精確的對單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)顆
2、粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀(流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer )是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)的特點(diǎn)檢測對象:單細(xì)胞懸液或生物顆粒;檢測對象:單細(xì)胞懸液或生物顆粒;檢測參數(shù):多參數(shù);檢測參數(shù):多參數(shù);檢測特點(diǎn):單細(xì)胞水平分析;檢測特點(diǎn):單細(xì)胞水平分析;檢測速度:高速,最高達(dá)上萬個(gè)細(xì)胞檢測速度:高速,最高達(dá)上萬個(gè)細(xì)胞/秒;秒;檢測結(jié)果:精度高、準(zhǔn)確性好;檢測結(jié)果:精度高、準(zhǔn)確性好;可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選;可對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分選;流式細(xì)胞儀的分
3、類流式細(xì)胞儀的分類分析型分析型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶,不能回收利用。細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶,不能回收利用。分選型分選型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀既能流式分析,還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選;既能流式分析,還能對分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選;進(jìn)樣管道較長,還需要保持無菌狀態(tài),所以分選型流進(jìn)樣管道較長,還需要保持無菌狀態(tài),所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選。式細(xì)胞儀一般只用于分選。流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化流式細(xì)胞儀的發(fā)展及商品化1934 Moldavanl:First try(固定式細(xì)胞分析固定式細(xì)胞分析-流動式流動式);1953 Crosland-Taylor:鞘流系統(tǒng)鞘流系統(tǒng)
4、(解決難題解決難題);1956 Coulter原理原理(血細(xì)胞計(jì)數(shù)器血細(xì)胞計(jì)數(shù)器);1965 Kamentsky:分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用;分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分和散射光應(yīng)用;1967 Kamentsky等設(shè)計(jì)了細(xì)胞分選的裝置;等設(shè)計(jì)了細(xì)胞分選的裝置;1969 Vandilla等等:第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)第一臺熒光檢測細(xì)胞計(jì)(鞘流聚焦、激光鞘流聚焦、激光);1972 斯坦福大學(xué)斯坦福大學(xué):研制出熒光激活細(xì)胞分選儀研制出熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS);1973 BD公司與斯坦福大學(xué)合作,研制生產(chǎn)第一臺商用流公司與斯坦福大學(xué)合作,研制生產(chǎn)第一臺商用流 式細(xì)胞儀式細(xì)胞儀-FACS。1975
5、Kohler和和Milstein:單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)(促進(jìn)流式發(fā)展促進(jìn)流式發(fā)展)。BD公司分析型流式細(xì)胞儀公司分析型流式細(xì)胞儀FACS Calibur 雙激光四色,市場覆蓋率最高LSR II 雙激光六色,三激光八色,四激光十色,分析型最高配FACS Canto II 雙激光六色,三激光八色FACS Verse雙激光六色,三激光八色BD公司分選型流式細(xì)胞儀公司分選型流式細(xì)胞儀FACSVantage SEFACSAria IIIInflux1.2 流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測流式細(xì)胞術(shù)光信號檢測 光信號的類型光信號的類型散射光信號散射光信號:與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān),與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān),是細(xì)胞的固有參數(shù)。
6、是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光前向散射光(forward scatter,FSC);側(cè)向散射光側(cè)向散射光(side scatter,SSC).熒光信號熒光信號自發(fā)熒光自發(fā)熒光 (細(xì)胞色素因子、核黃素細(xì)胞色素因子、核黃素):微弱:微弱特異熒光:標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出特異熒光:標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出 的熒光,比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。的熒光,比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。1.2.1 散射光信號散射光信號(一)前向散射光(一)前向散射光FSC FSC信號方向與激光束平行,偏離度一般在信號方向與激光束平行,偏離度一般在1-6度范圍內(nèi),度范圍內(nèi),亦稱小角度散射光,主要反映被測細(xì)胞的亦稱小角度散射光,主要反映被測細(xì)胞的體積大小
7、和活力體積大小和活力。(二)側(cè)向散射光(二)側(cè)向散射光SSCSSC方向與激光束和液流形成的平面相垂直,亦稱方向與激光束和液流形成的平面相垂直,亦稱90度散度散射光,其信號強(qiáng)度反映射光,其信號強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞內(nèi)部顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化。(三)散射光的作用(三)散射光的作用實(shí)驗(yàn)中,常利用實(shí)驗(yàn)中,常利用FSC和和SSC這兩種參數(shù)的組合,區(qū)分不同的這兩種參數(shù)的組合,區(qū)分不同的細(xì)胞群體,去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。細(xì)胞群體,去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片死細(xì)胞死細(xì)胞或碎片或碎片粘連粘連
8、細(xì)胞細(xì)胞腫瘤細(xì)胞株腫瘤細(xì)胞株FSC/SSC散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖死細(xì)胞死細(xì)胞加藥處理后加藥處理后FSC/SSC散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖通過通過FSC/SSC散點(diǎn)圖,散點(diǎn)圖,gate出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。出目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分析。1.2.2 熒光信號熒光信號(一)熒光:(一)熒光:物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài),再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。為高能狀態(tài),再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長發(fā)射波長(熒光波長熒光波長)Emission wavelength激發(fā)波長激發(fā)波長Excitation wavelength(二)常用熒光素(二)常用熒光素499nm 藍(lán)色熒光(藍(lán)色熒光
9、(Blue);500-549nm,綠色熒光(,綠色熒光(Green);550-584nm,黃色熒光(,黃色熒光(Yellow);585-615nm,橙色熒光(,橙色熒光(Orange);616-700nm,紅色熒光(,紅色熒光(Red);700nm,遠(yuǎn)紅外熒光(,遠(yuǎn)紅外熒光(Far-Red)。標(biāo)記抗體的熒光素標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿訜晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長激發(fā)光波長(nm)發(fā)射光波長發(fā)射光波長(nm)中文名中文名FITC490520異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE488575藻紅蛋白藻紅蛋白PerCP490675多甲藻葉綠素蛋白多甲藻葉綠素蛋白APC650660別藻青蛋白別藻青蛋白PE-Cy54
10、96/546670藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素5PE-Cy7496/546767藻紅蛋白藻紅蛋白-花青素花青素7Alexa Flour 488495519Alexa Flour 647650665核酸熒光染料核酸熒光染料PI(碘化丙啶(碘化丙啶 535,623)可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用可選擇性的插入核酸雙螺旋堿基對中。常用于于DNA分析,需要用分析,需要用RNase處理細(xì)胞排除處理細(xì)胞排除RNA對對DNA熒光定量的影響;熒光定量的影響;PI不能透過活細(xì)胞膜,常用于鑒定死細(xì)胞。不能透過活細(xì)胞膜,常用于鑒定死細(xì)胞。7-AAD(7-氨基放線菌素氨基放線菌素D 545,647)以插入的
11、方式與以插入的方式與DNA鏈的鏈的G-C堿堿基對結(jié)合,不能透過活細(xì)胞膜,常用于鑒定死細(xì)胞?;鶎Y(jié)合,不能透過活細(xì)胞膜,常用于鑒定死細(xì)胞。DAPI(4,4,6-二脒基二苯基吲哚二脒基二苯基吲哚 358,456)可以非嵌入方式與可以非嵌入方式與DNA鏈鏈上的上的A-T堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料,一種理想堿基對特異性結(jié)合。變異系數(shù)明顯小于其他染料,一種理想的的DNA定量染料。定量染料。Hoechst(343,450)常見為常見為Hoechst33342和和Hoechst33258,非嵌入的,非嵌入的方式與方式與DNA鏈上的鏈上的A-T堿基對結(jié)合。能對活細(xì)胞染色,用于活細(xì)胞堿基對結(jié)合。
12、能對活細(xì)胞染色,用于活細(xì)胞DNA定量分析,如精子分選;還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。定量分析,如精子分選;還用于側(cè)群細(xì)胞的分選。PY(派若寧(派若寧 560,573)RNA染料,能進(jìn)入活細(xì)胞。染料,能進(jìn)入活細(xì)胞。AO(吖啶橙(吖啶橙 509,525)DNA、RNA染料,染色后染料,染色后DNA呈黃綠色熒光,呈黃綠色熒光,RNA呈橙黃色熒光,可進(jìn)行呈橙黃色熒光,可進(jìn)行DNA/RNA雙參數(shù)分析。雙參數(shù)分析。1.3 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)組成液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)流動室流動室液流驅(qū)動系統(tǒng)液流驅(qū)動系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激發(fā)光源激發(fā)光源光束收集系統(tǒng)光束收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換器光電轉(zhuǎn)換器數(shù)據(jù)處理系
13、統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)噴嘴噴嘴電偏轉(zhuǎn)板電偏轉(zhuǎn)板樣本收集器樣本收集器1.3.1 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)鞘流技術(shù):根據(jù)層流原理發(fā)鞘流技術(shù):根據(jù)層流原理發(fā)展起來的技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)兩展起來的技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動,樣本細(xì)種液體的同軸流動,樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動,外胞流位于軸心穩(wěn)定流動,外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。流體動力學(xué)聚焦:穩(wěn)定的液流體動力學(xué)聚焦:穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入流從截面積較大的部分流入截面積較小的部分后,有一截面積較小的部分后,有一個(gè)聚焦收縮作用,細(xì)胞流直個(gè)聚焦收縮作用,細(xì)胞流直徑被約束在徑被約束在10-20um,避免,避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入
14、檢測區(qū)。了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測區(qū)。鞘液鞘液鞘液鞘液細(xì)胞流細(xì)胞流激光照射點(diǎn)激光照射點(diǎn)流體動力學(xué)聚焦示意圖流體動力學(xué)聚焦示意圖1.3.2 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)(一)(一)激發(fā)光源激發(fā)光源 :激光器:激光器氣體激光器:氬離子氣體激光器:氬離子(488nm、355nm)、氦氖、氦氖(633nm)、氪離子、氪離子 (647nm)、氪氬、氪氬(568nm);染料激光器:如氬離子激光泵浦的染料激光器:如氬離子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激水溶液染料激 光器,發(fā)出光器,發(fā)出550-650nm可變波長可變波長激發(fā)光;激發(fā)光;半導(dǎo)體激光器半導(dǎo)體激光器:價(jià)格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。價(jià)格低、結(jié)構(gòu)簡單、壽命長。
15、BD的的FACS Calibur 已采用已采用635nm半導(dǎo)體激光器。半導(dǎo)體激光器。激光特點(diǎn):單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。激光特點(diǎn):單波長、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照?,F(xiàn)在儀器常配有儀器選配現(xiàn)在儀器常配有儀器選配2-4根激光器,波長多為根激光器,波長多為488nm、633nm和和355nm、405nmUV;(二)光收集系統(tǒng)(二)光收集系統(tǒng)濾光片濾光片的組成的組成長通濾片長通濾片(LP):只允許特定波長以上的光束通過;:只允許特定波長以上的光束通過;短通濾片短通濾片(SP):只允許特定波長以下的光束通過;:只允許特定波長以下的光束通過;帶通濾片帶通濾片(BP):只允許一定波長范圍
16、內(nèi)的光束通過。:只允許一定波長范圍內(nèi)的光束通過。Long pass Short pass Band pass460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50460 500 540460 500 540全反射光路全反射光路FACS Aria流式細(xì)胞儀器信號檢測系統(tǒng)流式細(xì)胞儀器信號檢測系統(tǒng)PE-Cy7PerCP-Cy5.5PE-TexasRedPEFITCSSC1.3.3 電子系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電檢測器光電檢測器將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。將光信號轉(zhuǎn)換成電子信號。前置放大電路前置放大電路將信號等比例放大,輸出電脈沖信號。將信號等比例放大,輸出電脈沖信號
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