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1、第一(dy)部分核酸的制備分離純化第一頁，共23頁。核酸的制備（分離(fnl)、純化）一、總論二、以質(zhì)粒DNA為例談DNA的分離純化三、以真核生物為代表介紹總RNA的純化四、核酸的進一步純化（聚乙二醇、氯化銫梯度(td)離心第二頁，共23頁。500ulTE（PH8溶解沉淀離心，室溫8000rpm5min明火加熱至沸騰，并不停搖晃(yohung)離心，室溫8000rpm5min立即將其浸入沸水中40秒其它如肝素(ns)、DTT、SDS等都是RNA酶的抑制劑，在RNA提純中經(jīng)常使用離心，410000rpm10min5%agarosegel）：0.分離核酸的基本依據(jù)、方法(fngf)？20*硼酸緩沖

2、液（）5*MOPS緩沖液(避光保存)RNA分子量104-106或者更大。將細菌沉淀物重懸于預(yù)冷的10mlSTET中結(jié)構(gòu)(jigu)決定性質(zhì)，性質(zhì)是分離的基礎(chǔ)。DNA和RNA分離時的主要差別？立即將其于DNA氯化銫溶液混勻用1-2ul樣品電泳觀察。問題(wnt)：分離核酸的基本依據(jù)、方法(fngf)？核酸分離主要需要注意的是什么？DNA和RNA分離時的主要差別？第三頁，共23頁。不同的生物體中，核酸所處的環(huán)境不盡相同：1、核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密程度不同。2、DNA與RNA含量有差別。3、核酸分子量大小有差別。4、.由于核酸性質(zhì)基本相同，生物體所組成的成分基本相同，因此，對于不同的生物體核酸的分離方

3、法(fngf)相差不大。第四頁，共23頁。以上是常見核苷酸結(jié)構(gòu)(jigu)，中性PH下的離子狀態(tài)的鈉鹽形式。結(jié)構(gòu)(jigu)決定性質(zhì)，性質(zhì)是分離的基礎(chǔ)。第五頁，共23頁。核酸(h sun)的結(jié)構(gòu)特點：分子巨大，有共扼雙鍵、氫鍵、苷鍵、和磷酸二酯鍵，自由氨基、磷酸基。核酸的二級結(jié)構(gòu)：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；RNA大多為單鏈，鏈的許多區(qū)域或自身發(fā)生回折，回折區(qū)內(nèi)(qni)的多核苷酸段呈螺旋結(jié)構(gòu)。第六頁，共23頁。棄上清，收集細菌細胞。取出后，立即在4離心18000rpm,30min。5mmol/LEDTA(pH8)明火加熱至沸騰，并不停搖晃(yohung)核酸的制備（分離(fnl)、純化）核酸的二級結(jié)構(gòu)

4、：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)；75的乙醇(ychn)洗滌一次，室溫或真空干燥。從經(jīng)過(jnggu)純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠RNA4.棄上清，沉淀溶于200ul變性液中。3、核酸分子量大小有差別。加熱(jir)至30并溫和混勻。放置(fngzh)510min(0)。動物組織(zzh)總RNA的制備其于常規(guī)試劑配制不列舉。酚：氯仿(lfn)和氯仿(lfn)各抽提一次核酸性質(zhì)核酸性質(zhì)與其結(jié)構(gòu)(jigu)和組分是密切相關(guān)的分子量大?。篟NA和DNA的分子量都很大。RNA分子量104-106或者更大。DNA分子量106-2.2109。性狀和溶解度：DNA多為白色纖維狀固體。RNA為白色粉末。都微溶于水，他們

5、的鈉鹽在水中溶解度較大，都溶于2-甲氧乙醇，但不溶于一般有機溶劑（如：乙醇、乙醚、氯仿、戊醇和三氯醋酸等）。吸收光譜：具有共扼雙鍵的嘌呤(piolng)和嘧啶，故皆具有獨特的紫外吸收光譜。核酸在240-260nm的紫外波段有強烈的吸收峰。最大吸收值在260nm附近。通過OD260/OD280的比值可判斷樣品的純度。純DNA的OD260/OD280，純RNA的OD260/OD280。核酸中若含雜蛋白或苯酚則比值明顯降低。對于純核酸樣品只要讀出260nm的OD值，即可算出含量，通常：1OD260=50ug/ml（雙螺旋DNA）、1OD260=40ug/ml（單螺旋DNA或RNA）、1OD260=2

6、0ug/ml（寡核苷酸）。變性：加熱、強酸堿或射線及一切可破壞核酸分子氫鍵的處理。變性后的核酸理化性質(zhì)、生物功能都會有顯著變化，最重要表現(xiàn)為粘度下降。降解：酸、堿、核酸酶都可使核酸不同程度的降解。第七頁，共23頁。分離(fnl)核酸共同要考慮的防止(fngzh)核酸變性與降解：低溫操作。分離過程需加入必要的核酸解聚酶的抑制劑（如：乙二胺四乙酸（EDTA）、檸檬酸鹽、皂土、8-羥基喹啉、SDS、苯酚等）脫蛋白：在生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合以核蛋白形式存在，核酸所處的任何生物環(huán)境都含有蛋白質(zhì)，所以在核酸純化過程中需使用脫蛋白劑。（如：氯仿、苯酚、SDS、蛋白酶等使蛋白質(zhì)降解或變性，達到與核酸分離的

7、目的。DNA和RNA的分離：1、利用DNA和RNA在不同鹽濃度下，溶解度不同進行分離（DNA在1-2M時溶解度大，RNA溶解度小。相反，RNA在低鹽濃度時溶解度大，DNA小。）2、通過使用DNA或RNA酶，達到DNA和RNA分離的目的。3、根據(jù)分子量不同，進行梯度離心，進行分離。核酸的收集：多用乙醇、異丙醇第八頁，共23頁。質(zhì)粒DNA純化(chn hu)細菌培養(yǎng)從LB瓊脂扳上挑取一個單菌落。接種到含有適當抗生素的20ml液體LB中。37搖床培養(yǎng)過夜（OD）。將上述(shngsh)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入500ml含抗生素的液體LB培養(yǎng)基中。37300rpm約34hr（）。加入2.5ml氯霉素（34mg/ml

8、溶于乙醇），使終濃度為170ug/ml。300rpm37繼續(xù)培養(yǎng)1216hr。離心44000rpm15min。棄上清。將細菌沉淀重懸于100ml預(yù)冷的STE中。離心44000rpm15min。棄上清，收集細菌細胞。LB培養(yǎng)基Trypone10gYeastextract5gNaCl10g加水至1LSTE：（PH8）1mmol/LEDTA（PH8）第九頁，共23頁。1、酚提取(tq)法：將收獲的細胞重懸在20ml含20蔗糖的TES中。加 入 新 鮮 配 制 的 溶 菌 酶 到 終 濃 度 為1mg/ml（枯 草 桿 菌 和 大 腸 桿 菌）或5mg/ml（蘇蕓金桿菌）。37保溫3090分鐘，原生質(zhì)

9、游離出來。向原生質(zhì)溶液中加8SDS20ml和5MNaCl10ml。68保溫5min。將溶液儲于4冰箱，8hr以上或過夜(guy)。取出后，立即在4離心18000rpm,30min。取上清。向上清中加入等體積的重蒸酚（PH67），輕搖。置冰箱15min，離心取水相。重復(fù)一次。再用等體積的氯仿異戊醇（24：1）抽提12次。離心取水相。加入等體積的乙醚抽提12次。向水相加兩倍體積95冷乙醇(ychn)。20過夜或70半小時。離心15000rpm,20min,沉淀DNA。75的乙醇(ychn)洗滌一次，室溫或真空干燥。沉淀溶于PH8的TE緩沖液中。第十頁，共23頁。2、堿裂解法 將細菌沉淀重懸于10m

10、l Slution 1中。加入1ml新配制的溶菌酶。加入20ml新配制Slution 2，充分混勻。放置(fngzh)510min(0)。加入15ml預(yù)冷的Slution 3 混勻 置冰上10min 離心，4，10000rpm/min,15min 取上清并加入倍體積的異丙醇充分混勻 室溫放置(fngzh)10分鐘 離心，室溫5000rpm,15min 棄上清，用70乙醇洗滌棄乙醇，干燥。用3ml TE(PH8)溶解核酸沉淀可用氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心或聚乙二醇沉淀繼續(xù)純化 SlutionI50mmol/L葡萄糖25mmol/LTrisCl(PH8)10mmol/LEDTA(PH8)Sluti

11、on20.2mol/LNaOH(用時用10mol/L儲存(chcn)液稀釋)1SDSSlution35mol/L乙酸鉀60ml冰乙酸水第十一頁，共23頁。3、煮沸裂解法：將細菌沉淀物重懸于預(yù)冷的10ml STET中 加入1ml(10mg/ml,溶于10mmol/L Tris,PH8)新配制的溶菌酶 室溫下放置10分鐘明火加熱至沸騰，并不停搖晃(yo hung)立即將其浸入沸水中40秒 再將其浸入冰水中5分鐘 離心，4 15000rpm,30min 取上清，用乙醇或異丙醇沉淀 可繼續(xù)用氯化銫溴化乙錠梯度離心純化 STET10mmol/LTris.Cl(PH8)1mmol/LEDTA(PH8)5T

12、ritonX100第十二頁，共23頁。4、SDS裂解(li ji)法：將細菌沉淀物重懸于10ml，預(yù)冷的10蔗糖，50mmol/LTris.Cl(PH8)溶液中加入新配制的溶菌酶溶液加入EDTA(PH8)溶液，搖勻。置冰上10分鐘加4ml10%SDS,馬上用玻璃棒迅速混勻內(nèi)容物。立即加入6ml5mol/LNaCl(使終濃度為1M混勻。置冰上1hr離心15000rpm,30min取上清酚：氯仿(lfn)和氯仿(lfn)各抽提一次取水相，并加兩倍體積乙醇，混勻。放置室溫下12小時離心，45000rpm20min。棄上清，用70乙醇洗滌離心，45000rpm20min，取沉淀。用3mlTE(PH8)

13、溶解DNA可用氯化銫溴化乙錠梯度離心繼續(xù)純化第十三頁，共23頁。DNA繼續(xù)(jx)純化聚乙二醇沉淀法純化DNA：取3ml溶于TE中的核酸溶液，加入3ml預(yù)冷5mol/LLiCl溶液，充分混勻。離心，410000rpm10min取上清并加入等體積的異丙醇，混勻。離心，室溫(sh wn)，10000rpm 10min棄上清，用70乙醇洗滌沉淀保 留 沉 淀 并 用 500ul含 胰 RNA酶（20ug/ml）的TE（PH8溶解沉淀。室溫(shwn)放置半小時加入500ul含13（W/V）聚乙二醇的，充分混勻。離心，412000rpm5min去上清，保留沉加入400ulTE(PH8)溶解沉淀用酚、酚

14、：氯仿、氯仿各抽提一次取水相并加入100ul10ml/L乙酸銨混勻，并加入兩倍體積乙醇室溫(shwn)放置10min離心，412000rpm5min回收沉淀加入200ul4的70乙醇，混勻。棄上清，等乙醇蒸發(fā)殆盡500ulTE（PH8溶解沉淀儲存DNA于20或70第十四頁，共23頁。DNA繼續(xù)(jx)純化1、氯化銫溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA（連續(xù)梯度離心法精確測量DNA溶液的體積按1g/ml的用量加入固體CsCl加熱(jir)至30并溫和混勻。每10mlDNA溶液加入溴化乙錠溶液（10mg/ml溶于水立即將其于DNA氯化銫溶液混勻離心，室溫8000rpm5min將下層清亮紅色溶液轉(zhuǎn)移

15、到適當?shù)碾x心管中用輕石蠟油加滿，并封口。離心，2045000rpm16hr結(jié)果第十五頁，共23頁。DNA繼續(xù)(jx)純化收集閉環(huán)DNA從DNA中除去溴化乙錠2、不連續(xù)梯度離心：此方法是將不同濃度(nngd)的CsCl溶液分層加到離心管中，這樣可加速CsCl梯度的形成，使離心時間減少到6hr。第十六頁，共23頁。從經(jīng)過(jnggu)純化的質(zhì)粒DNA中去除溴化乙錠方法1：有機(yuj)溶劑抽提將DNA溶液放入試管中加等體積的飽和1丁醇或異戊醇振蕩混勻兩相離心，室溫1500rpm3min取水相反復(fù)抽提46次直到粉紅色從水相中和有機(yuj)相中消失。第十七頁，共23頁。從經(jīng)過純化(chn hu)的質(zhì)

16、粒DNA中去除溴化乙錠方法(fngf)2：離子交換層析如圖所示，用吸管裝一支DowexAG50樹脂的柱子（裝柱前需將樹脂進行平衡）。平衡方法(fngf)如下：1、適量DowexAG50樹脂溶于100ml1mol/LNaOH中，攪拌5分鐘，待樹脂沉淀后，吸出上清棄去。2、加100ml1mol/LHCl，繼續(xù)攪拌5分鐘，樹脂沉淀后，吸出上清棄去。3、用水重復(fù)步驟兩次（每次100ml），然后用TEN緩沖液（100ml）重復(fù)步驟2一次。TEN緩沖液：（0.1mol/LTris.Cl(pH8.0)，0.01mol/LEDTA(pH8.0)，1mol/LNaCl）4、于4將樹脂儲存于含0.2%疊氮鈉的TEN緩沖液中。吸去樹脂上的緩沖液，用2倍體積的TE（）洗柱，將含有溴化乙錠和氯化銫的DNA直接加到樹脂上。收集流出物，當所有DNA溶液進入柱子后，用倍柱體積洗脫，同時繼續(xù)收集流出物。柱子(zh zi)流干后，將收集的流出物用2倍體積的水稀釋。用6倍體積的乙醇，于4下，沉淀DNA 15分鐘。4，1200轉(zhuǎn)/分 離心15分鐘，收集DNA沉淀。用4的70%乙醇洗沉淀，按上步重新離心，取沉淀。用適量TE（）