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1、基因工程目的基因工程目的(md)基基因的獲取因的獲取第一頁，共69頁。1第一節(jié) 基因組DNA片斷(pindun)化第二節(jié) 化學(xué)合成目的(md)基因第三節(jié) 目的基因的保存和擴(kuò)增第四節(jié) 目的基因的分離和擴(kuò)增第二頁，共69頁。目的(md)基因：研究某個(gè)基因，或者要克隆某個(gè)基因用于生產(chǎn)大量DNA和蛋白質(zhì)分子,首先(shuxin)都要把它從龐大的基因組中分離出來。你所感興趣和想研究的基因，稱為目的基因。第三頁，共69頁。目的目的(md)(md)基基因因需要(xyo)克隆的DNA片段。編碼(bin m)某種蛋白質(zhì)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系第四頁，共69頁。第五頁，共69頁?；瘜W(xué)合成法

2、 cDNA文庫(wnk)基因組DNA文庫(wnk)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lin sh fn yng)直接(zhji)分離法目的基因的制備目的基因的制備第六頁，共69頁。第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNA片斷片斷(pindun)化化一、限制性內(nèi)切酶法二、隨機(jī)(su j)片斷化第七頁，共69頁。第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNA片斷片斷(pindun)化化一、限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小(dxio)的片斷。酶切第八頁，共69頁。由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以(ky)直接與載體連接。1.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)(yudin)2.缺點(diǎn)(qudin)目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。目的基因也被切成碎片！

3、BamH IBamH IBamH Igene第九頁，共69頁。二、隨機(jī)二、隨機(jī)(su j)(su j)片片斷化斷化1.限制性內(nèi)切酶局部(jb)消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有(zhyu)一部分被隨機(jī)切開。內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度。限制性內(nèi)切酶的選用原則第十頁，共69頁。1）4bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個(gè)(y)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均(pngjn)每44（256）bp一個(gè)切點(diǎn)。隨機(jī)(su j)程度高。如Hae、AluI、Sau3A。內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連。（Sau3ABamH I）第十一頁，共69頁。2.機(jī)械機(jī)

4、械(jxi)切割切割法法（1）超聲波超聲波強(qiáng)烈(qin li)作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷。（2）高速(o s)攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷。第十二頁，共69頁。第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)合成目的化學(xué)合成目的(md)基因基因一、目前(mqin)常用的方法二、化學(xué)合成DNA片斷(pindun)的組裝三、寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)第十三頁，共69頁。第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)合成目的化學(xué)合成目的(md)基基因因一、目前常用(chn yn)的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合(xin h)成法自動(dòng)化合成法。第十四頁，共69頁。保護(hù)(boh)dNTP的5

5、端-OH 或3端P 用酸或堿的脫保護(hù)(boh)（1）原理(yunl)1.磷酸二酯法磷酸二酯法 帶保護(hù)的單核苷酸連接保證合成反應(yīng)的定向進(jìn)行。帶5保護(hù)的單核苷酸與帶3保護(hù)的另一個(gè)單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。第十五頁，共69頁。（2）合成）合成(hchng)過程過程下一個(gè)5端保護(hù)的單核苷酸又可以(ky)同3端保護(hù)的二核苷酸聚合。第十六頁，共69頁。原理與磷酸二酯法一樣(yyng)。只是參加反應(yīng)的單核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先連接了一個(gè)保護(hù)基團(tuán)。2.磷酸三酯法磷酸三酯法第十七頁，共69頁。固相磷酸三酯合成固相磷酸三酯合成(hchng)過程過程固相支持物結(jié)果(ji gu)是全保護(hù)的DNA：5

6、DMT,3固相支持物,最后脫保護(hù)。固相支持物固相支持物C第十八頁，共69頁。化學(xué)合成的DNA片斷一般(ybn)在200bp以內(nèi)。二、二、化學(xué)合成化學(xué)合成DNA片斷片斷(pindun)的組裝的組裝用T4多核苷酸激酶使各個(gè)(gg)片段的5端帶上磷酸。1.互補(bǔ)連接法預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。（2）5端磷酸化（1）互補(bǔ)配對(duì)（合成的DNA單鏈的5端是-OH）第十九頁，共69頁。T4 DNA連接酶T4多核苷酸激酶(jmi)使5-OH磷酸化完整(wnzhng)的DNA雙鏈（3 3）連接酶連成完整）連接酶連成完整(wnzhng)(wnzhng)雙鏈雙鏈第

7、二十頁，共69頁。2.互補(bǔ)互補(bǔ)(h b)延伸連延伸連接法接法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為(zuwi)另一個(gè)片斷延長(zhǎng)的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。355353T4DNA連接酶Klenow片段(pin dun)引物第二十一頁，共69頁。1.直接(zhji)合成基因三、三、寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)寡聚核苷酸化學(xué)合成的優(yōu)點(diǎn)(yudin)2.合成(hchng)引物3.合成探針序列4.定點(diǎn)突變合成合成帶有定點(diǎn)突變的基因片斷。第二十二頁，共69頁?；瘜W(xué)合成法獲取(huq)目的基因由已知氨基酸序列(xli)推測(cè)可能的DNA序列(xli)第二十三頁，共69頁。第二十四頁，共69頁。DN

8、A合成合成(hchng)儀儀5.合成人工接頭(ji tu)或銜接物含有各種酶切位點(diǎn)人工(rngng)接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第二十五頁，共69頁。第三節(jié)第三節(jié) 目的基因目的基因(jyn)的保存和擴(kuò)的保存和擴(kuò)增增一、基因文庫的構(gòu)建(u jin)二、cDNA文庫(wnk)的構(gòu)建三、文庫的查詢（screening）第二十六頁，共69頁。將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主(szh)細(xì)胞中保存和擴(kuò)增。理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫

9、。一、基因文庫的構(gòu)建(u jin)1.基因文庫（gene library）第三節(jié)第三節(jié) 目的基因目的基因(jyn)的保存的保存和擴(kuò)增和擴(kuò)增第二十七頁，共69頁。（2）目前(mqin)常用的載體 2.構(gòu)建基因文庫的載體構(gòu)建基因文庫的載體(zit)選選用用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組(zhn z)子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。（1）對(duì)載體的要求載體系列：容量為 24 kpcosmid載體：容量為 50 kb YAC：容量為 1 MbBAC:容量為 300 kb第二十八頁，共69頁。斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度(chngd)合

10、適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。（1）染色體DNA大片(d pin)段的制備3.基因文庫構(gòu)建的一般基因文庫構(gòu)建的一般(ybn)步驟步驟超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）。物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化。可得到10-30kb的隨機(jī)片斷。酶切法：第二十九頁，共69頁。（2）載體）載體(zit)與基因組與基因組DNA大片段的連大片段的連接接 粘性末端直接(zhji)連接載體與外源DNA大片(d pin)段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾。人工接頭法（adapter）人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。第三

11、十頁，共69頁。各種(zhn)酶的接頭可以向公司定做或購買。接上人工(rngng)接頭粘性(zhn xn)末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端 同聚物加尾第三十一頁，共69頁。第三十二頁，共69頁。限制酶切位點(diǎn)限制酶消化 除去中間片段cos LR coscos L左臂R cos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化 外源DNA與載體DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段 cos LR cos20 Kb 外源 DNA 片段 基因組文庫第三十三頁，共69頁。酵母人工(rngng)染色體基因組文庫的構(gòu)建第三十四頁，共69頁。4.基因組文庫基因組文庫(wnk)

12、的的大小大小一個(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆(k ln)數(shù)目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫包含(bohn)了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因 組DNA的百分?jǐn)?shù)N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）第三十五頁，共69頁。例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均(pngjn)長(zhǎng)度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小(dxio)；f：fragment大小(dxio)N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.1

13、105第三十六頁，共69頁。1.cDNA以mRNA為模板(mbn)逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。2.cDNA library二、二、cDNA文庫文庫(wnk)的的構(gòu)建構(gòu)建mRNAcDNA3355反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶引物利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫。第三十七頁，共69頁。（1）不含內(nèi)含子序列。（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)。（3）包含了所有(suyu)編碼蛋白質(zhì)的基因。（4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。3.cDNA文庫(wnk)的特點(diǎn)第三十八頁，共69頁。4.構(gòu)建構(gòu)建cDNA文庫的一般文庫的一般(ybn)步驟步驟m

14、RNA mRNA cDNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組(zhn z)DNA分子 cDNA文庫(wnk)逆轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制復(fù)制第三十九頁，共69頁。4.構(gòu)建cDNA文庫的一般(ybn)步驟（1）總RNA（total RNA）提取(tq)提取(tq)總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。第四十頁，共69頁。第三十二頁，共69頁。二、隨機(jī)(su j)片斷化第三十五頁，共69頁。20 Kb DNA 片段AAAAAAAAAAAAAAAA目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點(diǎn)。在測(cè)序膠上，每組擴(kuò)出50-100條長(zhǎng)度為100-500bp的帶。p:文庫包含(bohn)了整個(gè)基因組DNA的概率（99%

15、）內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)一個(gè)文庫要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆(k ln)數(shù)目。去掉(q dio)發(fā)卡結(jié)構(gòu)控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有(zhyu)一部分被隨機(jī)切開。Oligo(dT)引物的3端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)(do sh)第二個(gè)不再是T）。二、cDNA文庫(wnk)的構(gòu)建隨機(jī)(su j)程度高。第六十六頁，共69頁。分離(fnl)mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。利用mRNA都含有一段polyA尾巴(wi ba)，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。（2）mRNA的分離的分離(fnl)純純化化 原

16、理 mRNA的分離純化Column（柱）第四十一頁，共69頁。Oligo dT纖維(xinwi)柱層析法AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOligo dTOligo dTOligo dT第四十二頁，共69頁。第四十三頁，共69頁。反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶（3）cDNA的合成的合成(hchng)cDNA第一(dy)鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。用Oligo dT（或隨機(jī)引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。mRNAcDNA355AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物第四十四頁，共69頁。用堿處理或用RNaseH降解(jin ji)mRNA-DNA雜交分子中的mR

17、NA。mRNAcDNA3355反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶引物mRNAcDNA第一(dy)鏈3355引物cDNA第一鏈35引物 降解降解mRNA模板模板或RNaseH堿第四十五頁，共69頁。剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成(hchng)第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成(hchng)第二鏈DNA.。cDNA第一(dy)鏈5cDNA第二(d r)鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈53 cDNA第二鏈合成第二鏈合成第四十六頁，共69頁。去掉去掉(q dio)(q dio)發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)

18、導(dǎo)致(dozh)cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一(dy)鏈cDNA第二鏈53cDNA第一鏈cDNA第二鏈5353第四十七頁，共69頁。第四十八頁，共69頁。這種酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多(xdu)小片斷。妙用妙用(mio yn)RNaseH小片斷(pindun)正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷(pindun)。DNA Pol I除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第四十九頁，共69頁。mRNAcDNA35反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶引物mRNAcDNA第一(dy)鏈35引物mRNAcDNA第一(dy)鏈35mRNAmR

19、NADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈35RNaseHDNA ligase去引物第五十頁，共69頁。在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入(zhun r)受體菌。或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。5.cDNA5.cDNA與載體與載體(zit)(zit)連接：連接：接上人工(rngng)接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第五十一頁，共69頁。第五十二頁，共69頁。第五十三頁，共69頁。第五十四頁，共69頁。6.cDNA文庫文庫(wnk)的大的大小小一個(gè)cDNA文庫要包含(bohn)99%的mRNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目。N=l

20、n(1-p)ln(1-)p:文庫(wnk)包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細(xì)胞整個(gè)mRNA的比例N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）1n1n第五十五頁，共69頁?；蚪M基因組DNA克隆克隆(k ln)cDNA克隆克隆(k ln)第五十六頁，共69頁。三、文庫三、文庫(wnk)的查詢的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進(jìn)行(jnxng)Southern blot雜交。文庫(wnk)載體探針電泳后雜交放射自顯影測(cè)序分析第五十七頁，共69頁。第四節(jié)第四節(jié) 目的目的(md)基因的分離和擴(kuò)增基因的分離和擴(kuò)增二、PCR擴(kuò)增獲得目的(md)基因一

21、、目的基因(jyn)的分離第五十八頁，共69頁。第四節(jié)第四節(jié) 目的基因目的基因(jyn)的分離和擴(kuò)的分離和擴(kuò)增增一、目的基因(jyn)的分離1.探針(tn zhn)柱分離特異mRNA根據(jù)已知的基因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。富集特定基因的mRNA或cDNA模板。第五十九頁，共69頁。纖維柱探針(tn zhn)DNA探針(tn zhn)DNA探針(tn zhn)DNA探針DNATotal mRNA纖維柱探針DNA探針DNA探針DNA探針DNA過柱與探針堿基互補(bǔ)的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。特異mRNA洗脫RT-PCR第六十頁，共69頁。2.mRNA消解

22、消解(xioji)雜交雜交原理(yunl)：羥基(qingj)磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。（Hydroxylapatite column）第六十一頁，共69頁。從表達(dá)(biod)A蛋白和不表達(dá)(biod)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)(biod)A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達(dá)(biod)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA就包括特異表達(dá)(biod)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測(cè)序。第六十二頁，共69頁。AAA組織(zzh)B組織(

23、zzh)總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白(dnbi)A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A 的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA單鏈濾過羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫第六十三頁，共69頁。3.mRNA差異差異(chy)顯示顯示PCR（DD RT-PCR）mRNA differential display RT-PCR（1）3端的(dund)錨定引物Oligo(dT)引物的3端加兩個(gè)核苷酸（倒數(shù)(do sh)第二個(gè)不再是T）。AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NM TTTTTTTTM：A、G or CN:A、G、T or C53第六十四頁，共69

24、頁。（2）12種錨定引物種錨定引物AGTTTTTTTT53CGTTTTTTTT53GGTTTTTTTT53TGTTTTTTTT53AA TTTTTTTT53CA TTTTTTTT53GATTTTTTTT53TATTTTTTTT53ACTTTTTTTT53CC TTTTTTTT53GCTTTTTTTT53TCTTTTTTTT53第六十五頁，共69頁。（3）5端的端的(dund)隨隨機(jī)引物機(jī)引物10 mer AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA35NM TTTTTTTT53擴(kuò)增cDNA第一(dy)鏈。RTNMTTTTTTTT5cDNA3NNNNNNNNNN53NNNNNNNNNN53cDNA第

25、二(d r)鏈，并PCR第六十六頁，共69頁。（4）隨機(jī)）隨機(jī)(su j)引物與錨定引物成對(duì)擴(kuò)引物與錨定引物成對(duì)擴(kuò)增增12種錨定引物，若與20種隨機(jī)(su j)引物，可組成240組引物。引物組合(zh)：240組在能分出20000多條帶！實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如果每條帶相當(dāng)于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細(xì)胞中全部的mRNA。在測(cè)序膠上，每組擴(kuò)出50-100條長(zhǎng)度為100-500bp的帶。第六十七頁，共69頁。（5）隨機(jī)）隨機(jī)-錨定引物錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳的產(chǎn)物電泳(din yn)比較比較不同組織的240組引物組合(zh)PCR產(chǎn)物在測(cè)序膠中電泳。選擇有差異(chy)的帶，進(jìn)一步PCR作探針。篩選文庫，找到差別基因的全長(zhǎng)序列。第六十八頁，共69頁。二、二、PCR擴(kuò)增獲得目的擴(kuò)增獲得目的(md)基基因因1.直接(zhji)從基因組中擴(kuò)增（1）提取(tq)基因組DNA作模板（2）根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物（3）PCR擴(kuò)增第六十九頁，共69頁。