轉錄組測序技術原理及應用.ppt
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1、RNA測序技術原理測序技術原理及應用及應用遺傳的中心法則遺傳的中心法則基因組基因組轉錄組轉錄組表觀遺傳組表觀遺傳組蛋白組層次蛋白組層次什么是轉錄組?All transcripts All mRNAsRNA是解讀基因組的關鍵是解讀基因組的關鍵RNAProteinPhenotypePhenotypeGenotypeGenotype DNA測序技術測序技術RNA-SeqRNA-SeqSmall RNA測序測序降解組測序降解組測序Non-coding RNA測序測序研究對象研究對象mRNASmall RNAmRNANon-coding RNA鑒定新分子鑒定新分子OOOO表達譜研究表達譜研究OOOO基因
2、結構分析基因結構分析O/XXXOEST 測序測序O/XXXX 篩選分子標記篩選分子標記 OOOX轉錄融合基因轉錄融合基因表達表達O/XXXXRNA 測序技術測序技術Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq樣品檢測樣品檢測文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析Total RNA樣品檢測樣品檢測 Agilent 2200 檢測檢測OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0;RIN7 新型安捷倫2200TapeStation系統(tǒng)是新一代測序(新一代測序(NGS)、生物微陣列
3、芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對生物樣品進行質(zhì)量控制(質(zhì)量控制(QC)的理想解決方案??蓴U展的通量16聯(lián)或96孔微量滴定板快速得到結果平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結果使用簡單可直接使用的ScreenTape預制膠條簡化了工作流程樣品用量少每次運行僅需要不到2ul樣品檢測報告檢測報告-合格樣品合格樣品棉鈴蟲/果蠅檢測報告檢測報告-不合格樣品不合格樣品Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq樣品檢測樣品檢測文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析真核真核mRNA的純化
4、的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo(dT)25磁珠純化原理主要是mRNA的3的poly A與磁珠在bindingbuffer的作用下相結合。磁珠通過MPC(磁分離器)從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結合后,再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠鏈霉親合素包被磁珠+生生物素標記物素標記Oligo(dT)25+poly(A)原核原核mRNA的純化的純化Ambion MICROExpress KitLNA扣鎖型探針扣鎖型探針mRNA反轉錄反轉錄-fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1 l的fragment buffer 7
5、0作用1.5min。加入1l的stop buffer終止反應。加入沉淀劑(NaAc 糖原 無水乙醇)沉淀產(chǎn)物。RTds cDNA末端修復(防止自連)cDNA 3末端加AAdapter連接第一天第一天消化消化DNAmRNA的分離的分離mRNA的打斷的打斷cDNA的合成的合成第二天第二天末端修復末端修復 加接頭加接頭膠回收膠回收3端加端加A第三天第三天PCRPCR膠回收膠回收 文庫制備文庫制備 文庫質(zhì)量檢測:文庫質(zhì)量檢測:Aligent 2100:片段大小、純度、濃度qPCR:片段大小、濃度手工檢測:跑膠驗證。Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq樣品檢測樣品
6、檢測文庫制備文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析生物信息分析ApplicationRNA-Seq(單端測序單端測序-Quantification)RNA-Seq(雙端測序雙端測序-Transcriptome)Expression-profilingAlternative SplicingFusion GeneSNP detectionHiSeq2500Applications of RNA-Seq17RNA-Seq(Transcriptome)Workflow of RNA-SeqWorkflow of RNA-Seq(Transcripto
7、me)(Transcriptome)生物信息學生物信息學分析分析RNA-Seq(Transcriptome)Characterize the transcriptome in unparalleled detailTechnique 220RNA-Seq(De novo transcriptome assembly)RNA-Seq(Transcriptome resequencing)RNA-Seq(De novo transcriptome assembly)文庫構建文庫構建測序測序組裝組裝De novo assemble a transcriptome組裝流程組裝流程數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)
8、的成分和質(zhì)量評估組裝結果分析(Contig 長度分布、Scaffold 長度分布、Unigene 長度分布)Unigene(transcript)功能注釋Unigene 的GO 分類Unigene 代謝通路分析預測編碼蛋白框(CDS)Unigene 表達差異分析(兩個或兩個以上樣品)Unigene 在樣品間的差異GO 分類(需兩個或兩個以上樣品)和Pathway 富集性分析De novo assembly transcriptome 信息分析主要信息分析主要內(nèi)容內(nèi)容:De novo assembly transcriptome信息分析流程信息分析流程Unigenes的的GO 注注釋釋Pathw
9、ay 分析分析RNA-Seq(Transcriptome resequencing)cDNA文庫構建文庫構建測序測序比對到參考序列比對到參考序列Transcriptome resequencing比對流程比對流程比對統(tǒng)計基因表達注釋基因差異表達分析基因結構優(yōu)化可變剪接分析預測新轉錄本cSNP分析Transcriptome resequencing信息分析主要內(nèi)容信息分析主要內(nèi)容Transcriptome resequencing信息分析流程信息分析流程應用應用-優(yōu)化轉錄組注釋信息優(yōu)化轉錄組注釋信息l基因基因結結構構優(yōu)優(yōu)化化l可可變變剪接剪接鑒鑒定定l基因融合基因融合鑒鑒定定lRNA水平水平SN
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