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1、中國藥科大學本科畢業(yè)論文解讀 中國藥科大學 本 科 畢 業(yè) 論 文 論文題目 TQ0701對大鼠腦缺血再灌注 損傷的保護作用 英文題目 Protective effects of TQ0701 on cerebralischemic reperfusion injury in rats 專 業(yè) 中藥學 院 部 中藥院 學 號 姓 名 指導教師 課 題 完成場所 中國藥科大學藥學院生理教研室 論文工作時間：年月 至 年月 TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用 目錄 摘要 . 1 前言 . 3 第一章 材料. 6 1.1 藥物和試劑 . 6 1.2 主要儀器 . 7 1.3 動物. 7 第

2、二章 方法. 8 2.1 TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠的神經功能和腦組織梗塞率的影響 . 8 2.2 TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響 . 9 2.3 統(tǒng)計學處理 . 9 第三章 結果. 10 3.1 TQ0701對局灶性腦缺血大鼠的神經功能和腦組織梗塞率的影響 . 10 3.2 TQ0701對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響 . 10 第四章 討論. 12 參考文獻 . 14 致謝 . 16 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用 學號 姓名 摘要：目的: 探討新型的化合物TQ0701對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的有效性，從而為該化合物

3、的機制研究以及臨床應用開發(fā)提供相關實驗數據和實驗思路。 方法: 將60只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性對照組（依達拉奉3mg/kg）、TQ0701低劑量組(1.5mg/kg)、中劑量組(3mg/kg)、高劑量組(6mg/kg)各10只。假手術組僅進行手術而不造成缺血狀態(tài)，其余各組均采用Longa線栓法制備大鼠MCAO模型，在缺血2h后進行再灌注。給藥組和陽性對照組分別在缺血前30min以及再灌注0、2h尾靜脈注射TQ0701和依達拉奉，假手術組和模型組則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。再灌注24h后觀察大鼠神經功能評分、腦組織梗塞百分率和病理組織學的改變。 結果: 模型組大鼠的神經功

4、能評分和腦組織梗塞百分率同假手術組、陽性對照組以及TQ0701三個劑量組相比有顯著差異，陽性對照組與TQ0701三個劑量組相比未見顯著差異。同時電鏡觀察結果也發(fā)現(xiàn)TQ0701三個劑量組及陽性對照組與模型組相比神經細胞病理改變較輕。 結論：化合物TQ0701對急性腦梗死有明顯的保護作用。 關鍵詞：TQ0701；腦缺血再灌注；依達拉奉； 1 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 Protective effects of TQ0701 on cerebral ischemic reperfusion injury in rats Abstract: Aim: To investigate the effec

5、ts of TQ0701 by dynamic changes of infarct volumes and neurological deficit scores on local cerebral ischemic-reperfusion injury in rats. Method: Male SD rats were randomly divided into sham-operated control group (n=10), normal saline control groups (n=10), edaravone-treated group (3mg/kg) (n=10) a

6、nd TxL-treated groups (6mg/kg, 3mg/kg and 1.5mg/kg) (n=10 each). Animals in the latter four groups were subjected to transient focal ischemia by the middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 120 minutes. The rats were pretreated with normal saline or TxL 30min before ischemic and 0min, 2hours afte

7、r reperfusion. After 24hours of reperfusion, infarct volumes were determined by 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) and neurological scores were investigated. Results: Infarct volumes in TQ0701-treated groups were significantly decreased compared with those in control groups at 24 after MCAO

8、, and the neurological deficit scores in TQ0701-treated groups were synchronously improved. Conclusion: These results show that treatment with TQ0701 can attenuate brain injury and TQ0701 may be a potential neuroprotective agent in cerebral ischemia-reperfusion. Key words: TQ0701; cerebral ischemic

9、reperfusion; edaravone 2 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 前言 目前，腦血管病嚴重危害人類健康，已成為三大死亡原因之一，其中缺血性腦血管病約占56.6%80% 。因此對于腦血管病治療藥物的研究與開發(fā)具有很大的實際價值和前景。 隨著對急性腦缺血再灌注和缺氧復氧損傷研究的進展，對腦梗塞的病理生理機制有了新的認識。大量研究已經證實了急性缺血后恢復血液灌流，會使病變加劇而發(fā)生再灌注損傷。目前主要從細胞內鈣離子、NMDA受體、自由基、花生四烯酸代謝、缺血區(qū)酸堿平衡破壞、基因表達及蛋白質的磷酸化等方面，對腦缺血再灌注損傷的機理和防治開展了廣泛而深人的研究。下面就幾個最基礎的病理生理機制

10、進行探討。 1. 鈣與缺血缺氧性腦損傷 細胞內鈣作為第二信使、代謝調節(jié)因子和膜穩(wěn)定劑在細胞正常機能活動中起重要作用，亦可介導多種病理情況下的細胞死亡。生理情況下，鈣在細胞內外存在很大的濃度差，這依賴于膜正常通透性及胞漿鈣外排機制來維持，后一過程需消耗能量。腦缺血缺氧時主要由于ATP供應不足、N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過度興奮介導與其偶聯(lián)的鈣通道開放、膜通透性增大及封阻機制障礙而致細胞外鈣內流增加、胞漿鈣外排障礙，造成細胞內Ca2+濃度增高1。細胞內Ca2+超載，一方面使血管收縮、進一步加重腦缺血缺氧；同時引起細胞代謝、結構與功能多方面的異常改變，從而導致細胞死亡。 2. 自由基連鎖

11、反應 腦缺血再灌注時，可通過黃嘌呤氧化酶、線粒體系統(tǒng)、白細胞系統(tǒng)、花生四烯酸相關酶系統(tǒng)、一氧化氮合成酶(NOS)系統(tǒng)等使自由基大量產生，同時自由基防御系統(tǒng)功能受損，動態(tài)平衡被打亂。自由基具有很高的化學活性，可快速攻擊其它化合物的分子并產生更多的自由基，自由基破壞膜結構中蛋白成分、引起膜脂質過氧化，導致膜損傷、線粒體功能障礙、溶酶體破裂、細胞溶解和組織水腫等一系列損害作用，稱之為自由基連鎖反應2-4。近年大量研究證實，氧自由基介導的自由基連鎖反應是導致腦缺血缺氧與再灌注復氧損傷的主要原因。 3. 興奮性氨基酸的神經毒性作用 3 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 生理情況下，興奮性氨基酸作為正常的神經遞

12、質，在神經元之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用。突觸前膜釋放的谷氨酸（GIU）主要通過神經細胞膜上的高親和性攝取系統(tǒng)攝取滅活，細胞外液GIU濃度維持在1umol/L左右。病理狀態(tài)下，GIU通過使神經元過度興奮而發(fā)揮其神經毒作用。在腦缺血缺氧時，GIU大量釋放，同時其再攝取機制受阻，在突觸中堆集，使NMDA受體過度興奮，啟動NMDA受體的控鈣通道而使外鈣大量內流，由此引發(fā)神經細胞的損傷。目前認為，細胞內鈣超載是介導興奮性氨基酸遞質神經毒性作用的關鍵因素。GIU主要與局灶性或不完全性腦缺血性損傷有關5。 4. 腦內NO的神經細胞毒性作用 NO在腦缺血損傷中的作用可能是雙重性的。它一方面可通過舒張腦血管和

13、抑制血小板聚集，下調NMDA受體，從而改善組織灌流、對缺血邊緣區(qū)腦組織施加直接保護作用，減輕缺血性損害；另一方面可通過形成自由基或其它途徑，而產生神經毒性，加重缺血損傷，促使缺血區(qū)邊緣腦組織向梗死發(fā)展。 5. 花生四烯酸代謝失衡 腦缺血再灌注時，通過AA代謝產生大量的TxA2、PGF2及白三烯(LT)C4、B4等物質。同時，由于合成酶抑制或內皮細胞損傷而致與TxA2、PGF2具有對抗作用的PGI2產生減少，造成TxA2/PGI2比值失衡。TxA2、PGF2和白三烯等可致血小板聚積、腦血管痙攣和血管通透性增加，加重腦缺血和腦水腫形成，導致缺血后遲發(fā)性低灌注損傷6：LTB4和12-羥花生四烯酸對白

14、細胞浸潤和激活起著放大作用。并且，AA自身代謝過程中，可產生大量O2-，從不同途徑導致組織損傷。可見，AA代謝失衡在腦缺血再灌注損傷中起著非常重要的作用。 依達拉奉首先由日本三菱東京制藥株式會社開發(fā)，202x年6月剛剛在日本上市。1984年日本三菱東京制藥株式會社根據酚類化合物具有強的自由基清除作用的原理,經過多次篩選,終于研發(fā)出一種神經元保護劑(自由基清除劑)依達拉奉。它是一種安替吡啉的代謝產物，其在體內以陰離子形式存在，血腦屏障通透性高，靜脈給藥可清除大腦內具有高度細胞毒性的羥自由基。因此，該藥最早用于腦缺血性病變急性期治療。研究表明，作為自由基清除劑，依達拉奉可有效改善腦組織缺血再灌注損

15、傷。腦缺血再灌注后，過多的氧自由基導致腦組織直接損傷及細胞膜脂質過氧化，破壞細胞膜結構和完整性，引起細胞膜通透性增加，細胞毒性 4 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 水腫增加。研究證實，依達拉奉能減少神經元NO合成酶，增加內皮型NO合酶，抑制腦線粒體通透性轉運孔開放，起到腦組織保護作用。另外，依達拉奉還能明顯抑制缺血區(qū)腦水腫，減少缺血再灌注引起的白三烯合成7。可見，依達拉奉能對缺血再灌注損傷的腦組織起到理想的保護作用。隨著該藥的腦保護作用逐漸得到臨床肯定，其適應癥進一步擴大，如治療心肌缺血、肺缺血、腎臟缺血、肝臟缺血和腸缺血等，其相關研究已取得較大進展。 鑒于依達拉奉良好的腦保護作用，在依達拉奉的基

16、礎上，對其進行結構改造，合成了新型化合物TQ0701。本課題就是主要觀察TQ0701對于腦缺血的保護作用，從而為該化合物的機制研究以及臨床應用開發(fā)提供相關實驗數據和實驗思路。 5 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 第一章 材料 1.1 藥物和試劑 1.1.1 TQ0701原料： 提供單位：江蘇正大天晴制藥有限公司 規(guī)格：純度為98.0以上 配制方法：按(1.2 mg TQ0701原料)：(1 mL 0.9%氯化鈉溶液)的比例配制成原液。TQ0701高劑量組，給予大鼠iv 0.5 mL/100g體重的原液；中劑量組需將原液用0.9%氯化鈉溶液稀釋一倍，給藥體積同上；低劑量組將原液稀釋兩倍，給藥體積同上

17、 1.1.2 依達拉奉(Edaravone)原料： 提供單位：江蘇正大天晴制藥有限公司 規(guī)格：純度為98.0以上 配制方法：按(0.6 mg 依達拉奉原料)：(1 mL 0.9%氯化鈉溶液)的比例配制成溶液。大鼠iv 0.5 mL/100g體重 1.1.3 水合氯醛(TCA): 提供單位：國藥集團化學試劑有限公司 規(guī)格：分析純 配制方法：用0.9%氯化鈉溶液配制成10%的溶液，大鼠ip 0.5 mL/100g體重 1.1.4 紅四氮唑(TTC)： 提供單位：上海靈錦精細化工有限公司 規(guī)格：分析純 配制方法：用PBS溶液配制成1%的溶液，4避光保存 1.1.5 PBS 溶液(g/L)： 配制方法

18、：每升蒸餾水加入NaCl 8.00g，KCL 0.20g，Na2 HPO4 H2O 0.156g， KH2PO4 0.20g，充分溶解 1.1.6 0.9%氯化鈉溶液： 提供單位：中國大冢制藥有限公司 6 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 規(guī)格：250ml/瓶 1.1.7肝素鈉注射液 提供單位：常州千紅生化制藥有限公司 規(guī)格：2mL:12500單位 配制方法：臨用前加0.9%氯化鈉溶液將肝素配制成125 /mL溶液 1.1.8 無水乙醇： 提供單位：無錫市亞盛化工有限公司 規(guī)格：分析純 配制方法：用蒸餾水配制成75%的溶液 1.1.9 甲醛溶液 提供單位：國藥集團化學試劑有限公司 規(guī)格：分析純 配制

19、方法：用蒸餾水配制成10%的溶液，避光保存 1.1.10 HE染色試劑盒： 提供單位：南京建成生物工程研究所 1.2 主要儀器 1.2.1 電熱恒溫水浴鍋： 江蘇省東臺市電器廠 1.2.2 分析天平： 北京賽多利斯天平有限公司 1.3 動物 SD大鼠，雄性，220260g，清潔級，生產許可證由河南省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCxK(豫)202x-0001； 使用許可證由中國藥科大學新藥篩選中心提供，使用許可證號：SYxK(蘇)202x-0010。 7 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 第二章 方法 2.1 TQ0701iv對局灶性腦缺血大鼠的神經功能和腦組織梗塞率的影響 取SD大鼠60只，雄

20、性，體重220260g，按體重隨機分為6組，分別為假手術組，模型組（均給以等量0.9%氯化鈉溶液），陽性對照組（依達拉奉3mg/kg），TQ0701高、中、低三個劑量組（6、3、1.5 mg/kg）。以上各組給藥容量均為0.5 mL/100g。參考Longa810等人的方法，采用頸內動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）ip 麻醉后仰臥恒溫手術臺上。從頸部正中切口，暴露右側頸總動脈，向外牽引二腹肌及胸鎖乳突肌，由頸總動脈分叉處向頭端依次游離，結扎并剪斷頸外動脈的分支：枕骨下動脈和甲狀腺上動脈，在頸外動脈遠端結扎，切斷頸外動脈使其主干游離備用

21、，然后分離頸內動脈，用絲線在頸外動脈根部打一松扣，夾閉頸總動脈和頸內動脈。將尼龍線（長5 cm，直徑0.28 mm）經頸外動脈主干切口，緩慢向頸內動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18 mm左右時感到阻力，即達到了較細的大腦中動脈內，阻斷了MCA的所有血供來源，扎緊頸外動脈根部松扣。2h后，拔出尼龍線，扎緊動脈殘端?？p合皮膚，完成MCAO導致局灶性腦缺血再灌注模型。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分叉，不閉塞MCA。TQ0701三個劑量組和陽性對照組分別在缺血前30min以及再灌注0、2h尾靜脈注射TQ0701和依達拉奉，假手術組和模型組則給予等量的0.9%氯化鈉溶液。 術后2

22、4 h 按Bederson的方法對動物的行為缺陷進行分級評分，標準如下11： 0分：無神經功能缺失癥狀；1分：提大鼠尾，見癱瘓側前肢回收屈曲不能正常伸向地面；2分：向癱瘓側推時感阻力較對側明顯降低；3分：大鼠爬行時向癱瘓側旋轉；4分：伴有意識障礙。 MCAO 24h后，斷頭處死大鼠，取出全腦（去除小腦）。在視交叉及其前后各2 mm處，做冠狀切片5片，于1% TTC中避光37孵育30 min，再分離蒼白區(qū)（梗塞區(qū)）和非蒼白區(qū)（正常區(qū)），計算梗塞百分比如下： 梗塞百分比(%)=蒼白區(qū)重量/(蒼白區(qū)重量+非蒼白區(qū)重量)x100% 8 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 2.2 TQ0701iv對局灶性腦缺血

23、大鼠腦組織學的影響 取SD大鼠60只，雌性，220260g，隨機分為6組，分組給藥及手術方法如前。MCAO后24h斷頭處死大鼠，取出全腦（去除小腦），于10 %甲醛溶液中固定。標本于臘制模具中切片后作HE染色，對大腦皮層海馬進行病理組織學檢查。 2.3 統(tǒng)計學處理 實驗數據用 表示。采用單因素方差分析進行組間顯著性比較, 兩組 間樣本均數比較采用t 檢驗。 9 中國藥科大學本科生畢業(yè)論文 第三章 結果 3.1 TQ0701對局灶性腦缺血大鼠的神經功能和腦組織梗塞率的影響 由表1可見：模型組的MCAO大鼠腦卒中評分明顯增加，梗死面積也明顯增大（P 表1.TQ0701對局灶性腦缺血大鼠行為學評分、

24、梗死面積的影響 （x?s，n=10） 組別 假手術組 模型組 陽性對照組 TQ0701給藥組 劑量 （mg/kg） 3 6 3 1.5 行為學評分 0.00. 0 3.30.5 1.70.8 1.50.6 1.90.7 2.60.7 梗死面積（） 41.43.5 19.72.5 20.13.0 25.96.3 36.05.6 P 3.2 TQ0701對局灶性腦缺血大鼠腦組織學的影響 （1） 假手術組：10例腦組織神經元基本正常，核居中，未見神經元明顯病變、 壞死及炎細胞浸潤等病理學改變。 （2） 模型組：10例腦組織大腦皮質神經元均見中重度變性、壞死（ ），神經元結構模糊，胞體腫脹，尼氏小體減少或消失，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解，神經元數目明顯減少，其中5例