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1、1.樣品：虎杖苷注射液 批號20040305。2.培養(yǎng)基：無菌檢查用硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，批號040203；霉菌液體培養(yǎng)基，批號040302；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號0403045；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，批號040513；0.1%蛋白胨溶液，批號050217；虎紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，批號040202；由中檢所所培養(yǎng)基室提供。3.方法：中國藥典2005版無菌檢查薄膜過濾法方法驗證 4.驗證試驗用菌種：驗證試驗用菌種包括金黃色葡萄球菌（26003）、銅綠假單胞菌（10104）、枯草芽孢 菌（63501）、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（98001）、黑曲霉菌（98003），來自中國醫(yī)學(xué)細菌保藏中心。5.菌液制

2、備：取經(jīng)34培養(yǎng)1824小時的金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至105107約為50100cfu/ml備用。6.供試液制備：取樣品10瓶分別加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，過濾。7.活菌計數(shù)活菌計數(shù)結(jié)果見表1。表1 活菌計數(shù)（cfu/ml）n 104稀釋105稀釋107稀釋試驗次數(shù)121212金黃色葡萄球菌5660枯草芽孢桿菌7779白色念珠菌8670黑曲霉菌8076銅綠假單胞菌47508 方法驗證直接接種法：取樣品12支，分別接種8支硫乙醇酸鹽和4支霉菌液體培養(yǎng)基2ml/支后，再按要求加入相應(yīng)的陽性菌液（3010

3、0個/ml），置規(guī)定溫度培養(yǎng)35天，逐日觀察結(jié)果。薄膜過濾法：取樣品11支，將樣品過濾于封閉式濾器（3聯(lián)筒/套），用0.1%蛋白胨氯化鈉溶液沖洗500ml后，再分別人工污染金黃色葡萄球菌、枯草桿菌50100個/筒即可，同時平行做稀釋劑的對照組。將稀釋劑對照濾筒和污染陽性菌的驗證濾筒置37培養(yǎng)35d，逐日觀察，結(jié)果見表1、2、3。表2 虎杖苷注射液無菌檢查法驗證（直接接種法）n 菌株 次數(shù) 管數(shù)培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽 霉菌 1 2 3 4 5 (d）1 2 3 4 5金黃色葡萄球菌112 21 2 31 2 白色念株菌1 1 2 +212 +312 +枯草桿菌112 212 312 黑曲霉112 +2

4、12 +312 +銅綠假單胞菌112 +212 +312 +生孢梭菌112 +212 +312 +表3 薄膜過濾法人工污染金黃色葡萄球菌（活菌數(shù)58cfu）n硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（100ml/濾器）實驗次數(shù)培養(yǎng)1d培養(yǎng)2d培養(yǎng)3d培養(yǎng)4d培養(yǎng)5d1（沖洗量500 ml）+2（沖洗量500 ml）+陰性對照（50 ml）表4 薄膜過濾法人工污染枯草桿菌（活菌數(shù)78cfu）n硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（100ml/濾器）實驗次數(shù)培養(yǎng)1d培養(yǎng)2d培養(yǎng)3d培養(yǎng)4d培養(yǎng)5d1（沖洗量500 ml）+2（沖洗量500 ml）+陰性對照（50 ml）9 結(jié)論：根據(jù)上述結(jié)果，由于采用直接接種法進行虎杖苷注射液的無菌檢查，存在對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌生長的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的無菌檢查應(yīng)依據(jù)中國藥典無菌檢查方法中的薄膜過濾法進行，沖洗量規(guī)定為500ml。方法學(xué)驗證越來越體現(xiàn)其重要性n方法學(xué)驗證越來越體現(xiàn)其重要性,但是微生物檢n驗的方法學(xué)驗證在2000版中國藥典中僅有一項n抑細菌和抑真菌試驗，這是遠遠不夠的。如果所n檢的樣品具有明確的抗菌活性,必須采用薄膜過濾n法檢驗時,就沒有確切的驗證試驗作為其無菌試驗n方法建立的保證,尤其在對報批的新藥進行技術(shù)復(fù)n核、試行標準轉(zhuǎn)正時,由于申報單位提供的技術(shù)資料n中沒有相關(guān)的微生物檢驗方法學(xué)研究內(nèi)容,復(fù)核工n作缺乏針對性,且常常陷于被動 謝謝！