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1、1.2基因工程的基本操作程序,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指_,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也有一些具有調(diào)控作用的因子,2、獲取目的基因的方法,（1）從基因文庫(kù)中獲取,（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,（3）人工合成,_,(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因,1.基因文庫(kù),將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。,2.基因文庫(kù)的分類(lèi):,種類(lèi),基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物

2、的部分基因，如：cDNA文庫(kù),基因文庫(kù)的構(gòu)建過(guò)程,通過(guò)對(duì)受體菌群體的培養(yǎng)而儲(chǔ)存一種生物的全部基因。,基因組文庫(kù),3.基因文庫(kù)的構(gòu)建方法,提取生物某發(fā)育時(shí)期的mRNA,單鏈DNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,雙鏈CDNA(只含該生物部分基因),與載體連接導(dǎo)入到受體菌群儲(chǔ)存,cDNA文庫(kù),基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)(補(bǔ)充內(nèi)容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),調(diào)控遺傳信息表達(dá),上游有啟動(dòng)子，下游有終止子,啟動(dòng)子,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)（補(bǔ)充內(nèi)容）

3、,編碼區(qū),與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),內(nèi)含子,外顯子,啟動(dòng)子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子,原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較,思考,編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？,連續(xù),不連續(xù),編碼區(qū),非編碼,真核生物mRNA的形成,編碼區(qū),非編碼區(qū),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),非編碼區(qū),轉(zhuǎn)錄,加工（剪切、拼接）,成熟mRNA,只對(duì)應(yīng)外顯子部分,初級(jí)轉(zhuǎn)錄物,補(bǔ)充資料,基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)比較,依據(jù)：目的基因的有

4、關(guān)信息如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性,4.從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法,概念：PCR全稱(chēng)為_(kāi)，是一項(xiàng)在生物_復(fù)制_的核酸合成技術(shù),條件：_、_、_、_、_,原理：_,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,模板DNA,四種脫氧核苷酸,DNA引物,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,（二）利用PCR擴(kuò)增目的基因,方式：以_方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,結(jié)果：_,指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增,過(guò)程,a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、復(fù)性（復(fù)性55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引

5、物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,前提_,有一段已知目的基因的核苷酸序列,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,推測(cè),推測(cè),目的基因,化學(xué)合成（DNA合成儀）,（三）人工合成,若基因_，核苷酸序列_，可用此法。,較小,已知,（化學(xué)合成法）,mRNA,cDNA單鏈,cDNA分子,逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,（三）人工合成,（反轉(zhuǎn)錄法）,與直接提取的DNA相比cDNA不含有_和_等結(jié)構(gòu)。,真核生物mRNA的形成,編碼區(qū),非編碼區(qū),RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn),非編碼區(qū),轉(zhuǎn)錄,加工（剪切

6、、拼接）,成熟mRNA,只對(duì)應(yīng)外顯子部分,初級(jí)轉(zhuǎn)錄物,補(bǔ)充資料,a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時(shí)使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用,1、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的,二、表達(dá)載體的構(gòu)建,2、基因表達(dá)載體的組成：,目的基因,標(biāo)記基因,啟動(dòng)子,終止子,啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái),用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。用_切斷目的基因，

7、使其產(chǎn)生_。,3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,(插入式),用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。用_切斷目的基因，使其產(chǎn)生_。,將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,用同種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，使之露出相同的黏性末端，在加入DNA連接酶。,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞,將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞

8、,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,Ca+處理法,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力,原理：,農(nóng)桿菌特點(diǎn)：,（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。,過(guò)程：,1、將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上,2、將重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,3、用農(nóng)桿菌感染植物體細(xì)胞,（2）基因槍法,適用于單子葉植物,（3）花粉管通道法,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞,方法：顯微注射法程序：,取卵,顯微注射,受精卵,早期胚胎培養(yǎng),胚胎移植,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞

9、,用Ca2+處理細(xì)胞,原核生物特點(diǎn)：,繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少,方法：,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,感受態(tài)細(xì)胞,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,抗原抗體雜交法,分子雜交法,DNA分子雜交法,目的基因是否翻譯,目的基因是否轉(zhuǎn)錄,目的基因是否導(dǎo)入,方法,檢測(cè)對(duì)象,結(jié)果,個(gè)體水平的鑒定,是否顯示出雜交帶,四、目的基因的檢測(cè)與鑒定,個(gè)體水平的鑒定（受體是否表現(xiàn)出相應(yīng)性狀）,1、鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是否具有抗蟲(chóng)性可采用_實(shí)驗(yàn),2、如何鑒定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否成功？,接蟲(chóng),在轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草田中澆灌鹽水，觀察其是否有抗鹽特性,3、用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)人血清白蛋白，如何

10、確定轉(zhuǎn)基因羊培養(yǎng)成功？,檢測(cè)羊乳中是否含有人的血清白蛋白,基因探針：（制作探針的要求）,含有目的基因,單鏈,標(biāo)記放射性同位素或熒光,歸納:基因工程的基本操作程序,獲取目的基因從基因文庫(kù)利用PCR技術(shù)人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：是否有轉(zhuǎn)基因特性,一、乳腺生物反應(yīng)器,1.目的基因是什么？,藥用蛋白基因,2.目的基因前需加的什么啟動(dòng)子？,乳腺蛋白基因的啟動(dòng)子,3.受體細(xì)胞是什么？,受精卵,4.分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞是？,乳腺分泌細(xì)胞,5.將目的基因?qū)胧荏w

11、細(xì)胞的方法？,顯微注射法,練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中。請(qǐng)回答：,1）將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫荏w細(xì)胞，常用方法是_。,顯微注射,2）進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移是，通常要將外源基因轉(zhuǎn)到_中，原因是：,受精卵,具有發(fā)育的全能性；,體積大，易操作。,3）在研制膀胱生物反應(yīng)器時(shí)，應(yīng)使外源基因在小鼠的_細(xì)胞中特異表達(dá)。,膀胱上皮,練習(xí)：繼哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)生器研發(fā)成功后，膀胱生物發(fā)生器的研究也取得了一定進(jìn)展。最近，科學(xué)家培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其膀胱上皮細(xì)胞可以合成人的生長(zhǎng)激素并分泌到尿液中

12、。請(qǐng)回答：,4）通常采用_技術(shù)檢測(cè)外源基因是否插入了小鼠的基因組,DNA分子雜交,6）與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱反應(yīng)器有什么優(yōu)點(diǎn)？,不受性別的限制；,沒(méi)有是否處于生殖期的限制。,5）檢測(cè)人的生長(zhǎng)激素是否成功表達(dá)可采用_技術(shù),抗原-抗體雜交,1、基因治療概念：,二、基因治療曙光初照,將健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的。（增補(bǔ)策略）,2、基因治療的類(lèi)型,3、基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀：,處于初期的臨床試驗(yàn)階段,三、蛋白質(zhì)工程的崛起,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類(lèi)對(duì)生產(chǎn)和生活的需求。,前提：,了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,途徑：,目的：,改造基因（基因修飾或基因合成）,定向改造或制造蛋白質(zhì),獲得自然界沒(méi)有的蛋白質(zhì),1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種偶蹄動(dòng)物傳染病，目前常用接種弱毒疫苗的方法預(yù)防。疫苗的主要成分是該病毒的一種結(jié)構(gòu)蛋白VP1?？茖W(xué)家嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因番茄來(lái)生產(chǎn)口蹄疫疫苗，過(guò)程如下圖所示。請(qǐng)據(jù)圖回答。,