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1、,枸杞多糖的提取與含量測定,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握提取多糖的原理和方法；2、掌握多糖的純化原理及方法；3、掌握多糖含量測定的原理及方法。,實(shí)驗(yàn)原理,多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、動(dòng)物多糖等等3大類。多糖的提取首先要根據(jù)多糖的存在形式及提取部位，決定在提取之前是否要做預(yù)處理。動(dòng)物多糖和微生物多糖多有脂質(zhì)包圍，一般提取時(shí)需要加入丙酮、乙醚、乙醇或是乙酸乙酯的混合液進(jìn)行回流脫脂，釋放多糖。植物多糖提取時(shí)應(yīng)該注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在提取前應(yīng)先用低極性的有機(jī)溶劑對原料進(jìn)行脫脂預(yù)處理，目前多糖的提取方法主要有溶劑提取法、生物提取法、強(qiáng)化提取法等等。,實(shí)驗(yàn)原理,易溶

2、于水的多糖的提取 水提取多糖中的多糖大多是中性多糖。用水作溶劑來提取多糖時(shí)，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。結(jié)合多糖的提取結(jié)合多糖主要指黏多糖。以新鮮組織或丙酮脫水的組織為原料，可用水或鹽溶液提取部分多糖。但是，以為大多數(shù)的黏多糖是與蛋白質(zhì)結(jié)合的，需要用酶降解蛋白質(zhì)部分或用堿使多糖和蛋白質(zhì)之間的糖肽鍵斷裂，以促進(jìn)黏多糖在提取時(shí)的溶解。在堿性提取的同時(shí)用蛋白酶處理組織，可將提取過程簡化。提取液中存在的蛋白質(zhì)可用普通蛋白質(zhì)沉淀劑沉淀，也可用其他方法進(jìn)行多糖的提純。,實(shí)驗(yàn)原理,多糖的提取液一般濃度較低，需在提取后對提取液進(jìn)行濃縮。濃縮的方法可根據(jù)性質(zhì)確定，如對熱比較穩(wěn)定的多糖，可用加熱蒸發(fā)或減

3、壓蒸出水分法；對于相對分子質(zhì)量大的多糖可用超濾法。向多糖溶液中加入一定量的與水混溶的有機(jī)溶劑（如乙醇）可得到粗多糖的沉淀物。Sevag法Sevag法是自多糖中去除蛋白質(zhì)的最緩和的方法，原理是利用蛋白質(zhì)變性沉淀而多糖不沉淀出去蛋白質(zhì)。將樣品提取液與Sevag試劑按照5:1的比例混合，劇烈震蕩后離心除去變性的蛋白質(zhì)，反復(fù)多次至蛋白質(zhì)除盡為止。該方法較為溫和，配合蛋白質(zhì)水解酶消化法使用效果更佳。,實(shí)驗(yàn)原理,蒽酮-硫酸比色法進(jìn)行多糖的含量測定糖類在較高溫度下可被硫酸作用而脫水生成糠醛或羥甲基糠醛后，與蒽酮（C14H100）脫水縮合，形成糠醛的衍生物，成藍(lán)綠色。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收，在150u

4、g/ml范圍內(nèi)，其顏色深淺可與可溶性糖含量成正比。這一方法有很高的靈敏度，糖含量30ug左右就可進(jìn)行測定，所以可作為微量測糖含量只用。一般樣品少的情況下，采用這一方法比較合適。,實(shí)驗(yàn)試劑儀器,實(shí)驗(yàn)試劑 干燥枸杞子、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒽酮、濃硫酸、95%乙醇、無水乙醇、三氯甲烷正丁醇（4:1）。實(shí)驗(yàn)儀器 分析天平、托盤天平、離心機(jī)（大）、離心機(jī)（?。?、水浴鍋、電爐、漩渦震蕩儀、真空烘箱、分光光度計(jì)、800ml燒杯、100ml燒杯、離心管、分液漏斗、50ml容量瓶、玻璃棒、量筒、加蓋試管若干。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,提取 粗略稱取20g 枸杞于，粉碎后放入800ml 燒杯中，加500ml 蒸餾水，熱水提取2h。

5、過濾，加入1/4 體積的三氯甲烷正丁醇（4:1），劇烈振搖15min，3000rpm 離心25min，棄去中間變性蛋白和氯仿層，留用上清液。上清液于80水浴攪拌濃縮至50ml。在攪拌狀態(tài)，將濃縮液加入3 倍體積95%乙醇中，室溫靜置1h 左右，3000rpm 離心10min，固形物用95% 乙醇洗滌，3000rpm離心10min,然后用無水乙醇洗滌，3000rpm離心10min, 真空干燥, 得LBP 粗品。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取干燥試管6 支，按下表數(shù)據(jù)配置一系列不同濃度的葡萄糖溶液。,在620nm波長下以第一管為空白試驗(yàn)，迅速測量吸光值，以葡 萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱

6、坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,枸杞多糖的含量測定 精密稱定20mg 多糖粗品，溶于50ml 蒸餾水中，制成樣品液。 分別吸取0.5ml，1ml 多糖溶液至試管中，加蒸餾水至總體積為1ml。冰浴中冷卻，再加入4ml 蒽酮試劑，沸水浴中煮沸10min，取出后自來水冷卻，620nm 比色，其他條件與作標(biāo)準(zhǔn)曲線同。測得吸光度值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品液的糖含量。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理,標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以下表格是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液吸光度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。,即可得到如下標(biāo)準(zhǔn)曲線。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理,枸杞多糖的含量測定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以查得枸杞多糖樣液吸光度的數(shù)值。,樣液1含0.02367mg枸

7、杞多糖，樣液2含0.04735mg枸杞多糖。,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄與處理,枸杞多糖的含量計(jì)算根據(jù)已經(jīng)查得的數(shù)值，可以進(jìn)行一下計(jì)算 c（樣品1）= （0.02367 mg / 0.5 ml）* 50 ml / 21.4 mg * 100% = 11.06% c（樣品2）= （0.04735 mg / 1.0 ml）* 50 ml / 21.4 mg * 100% = 11.06%,注意事項(xiàng),蒽酮-濃硫酸比色法的注意事項(xiàng)：該法的特點(diǎn)是幾乎可以測定所有的碳水化合物，所以蒽酮法測出的碳水化合物的含量，實(shí)際上是溶液中可溶性碳水化合物的總量。不同的糖類和蒽酮試劑顯色的深度不同，果糖最深，葡萄糖、半乳糖、甘露糖和五

8、碳糖依次降低，因此測定糖的混合物的時(shí)候，常常因不同糖類的比例不同造成誤差，但是測定單一糖類則可以避免此類誤差。在進(jìn)行枸杞多糖的提取提純的時(shí)候，一定要注意沉淀枸杞多糖所需乙醇的濃度，切不可加入無水乙醇而沒有意識(shí)到乙醇濃度的降低，引起提取枸杞多糖的量的降低。,注意事項(xiàng), 在Sevag法中，可以通過配合蛋白質(zhì)酶消化法達(dá)到更好的提純效果。在進(jìn)行枸杞多糖的定量測量的時(shí)候，一定要注意葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液以及樣品的用量，否則會(huì)造成較大誤差，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中要用線性回歸進(jìn)行擬合。在進(jìn)行620nm波長的吸光度測量時(shí)，一定要進(jìn)行比色池的校準(zhǔn)，否則將會(huì)帶來較大的誤差，比色池的校準(zhǔn)，直接用標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)第一組試劑進(jìn)行校準(zhǔn)即可，且必須在實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行校準(zhǔn)，及時(shí)交換吸光度不同的比色池，用吸光度小的比色池做100%吸光度的校準(zhǔn)池。,謝謝！,所有實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容。,