《第二章 細胞生物學研究方法.docx》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《第二章 細胞生物學研究方法.docx（9頁珍藏版）》請在匯文網上搜索。

1、第二章 細胞生物學研究方法(the research method in the cell biology)教學目的1、了解主要工具和常用方法，側重掌握基本原理和基本應用；2、認識工具和方法與學科發(fā)展的相關性。教學內容本章從以下5個方面介紹了細胞生物學的研究方法:1顯微成像技術2細胞化學技術3細胞分選技術4細胞工程技術5分離技術6分子生物學方法計劃學時及安排本章計劃3學時。教學重點和難點生命科學是實驗科學，它的很多成果都是通過實驗才得以發(fā)現和發(fā)展的。許多細胞生物學的重要進展以及新概念的形成,往往來自新技術的應用。因此,方法上的突破,對于理論和應用上的發(fā)展具有巨大的推動作用，這是學習本章應確立的

2、基本思想。1顯微成像包括直接成像和間接成像。顯微技術是細胞生物學最基本的研究技術, 包括光學顯微技術和電子顯微技術。在光學顯微技術中要掌握幾種常用顯微鏡成像的基本原理,包括普通雙筒顯微鏡、熒光顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、倒置顯微鏡。電子顯微鏡是研究亞顯微結構的主要工具, 透射和掃描電鏡的是兩類主要的電子顯微鏡, 對其基本結構、工作原理和樣品制備方法則是學習的重點。2細胞化學技術介紹了酶細胞化學技術、免疫細胞化學技術、細胞分選技術, 其中流式細胞分選技術是細胞生物學和現代生物技術中的重要技術, 應重點掌握。3細胞工程技術是細胞生物學與遺傳學的交叉領域，主要利用細胞生物學的原理和方法，結合工

3、程學的技術手段，按照人們預先的設計，有計劃地改變或創(chuàng)造細胞遺傳性的技術。包括體外大量培養(yǎng)和繁殖細胞，或獲得細胞產品、或利用細胞體本身。主要內容包括：細胞融合、細胞生物反應器、染色體轉移、細胞器移植、基因轉移、細胞及組織培養(yǎng)。 4分離技術是一大類技術的總稱，包括細胞組分的分離和生物大分子的分離, 應掌握各種分離技術的原理和用途。本章對分子生物學方法作了簡要介紹, 為今后的學習奠定基礎。簡言之，本章教學重點是儀器方法的基本原理和基本應用；教學難點是電鏡制樣及分子雜交技術。教學方法 講授、參觀教學過程2.1顯微成像技術2.1.1、光學和電子顯微鏡成像原理共同點：照明系統(tǒng)；被觀察的樣品；聚焦和成像的透

4、鏡系統(tǒng)不同點： 光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。 電子顯微鏡：以電子束為光源。表3-1電鏡與光鏡的比較利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡可見光（400-700） 紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）200nm100nmLMFMEM成像原理真空透鏡光源分辨本領顯微鏡電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造2.2.2、常用的光學顯微鏡 普通光學顯微鏡構成： 照明系統(tǒng) 光學放大系統(tǒng) 機械裝置原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。分辨力：指

5、分辨物體最小間隔的能力。 R=0.61/n sin(/2)或者 R=0.61/NA其中為入射光線波長；NA為物鏡的數值孔徑（numerical aperture)，sin/2，n=介質折射率；=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。 思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？顯微鏡的幾個光學特點： 制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65-1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。 sin/2的最大值必然小于1；介質為空氣，鏡口率一般為0.05-0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長為400-700nm，分辨力數值不會小于0.2m，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設計

6、倍數為1000X。 熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) 特點：光源為紫外線，波長較短；分辨力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。 用于觀察能激發(fā)出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。 激光共聚焦掃描顯微境(Laser confocal scanning microscope, LCSM) 用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。 能顯示細胞樣品的立體結構。 分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像。 相差顯微鏡 把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構

7、變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。環(huán)形光闌（annular diaphragm）：位于光源與聚光器之間。相位板（annular phaseplate）：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4。 用途：觀察未經染色的玻片標本 倒置顯微鏡（inverse microscope） 物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光裝置。2.2.3、 光學顯微鏡的樣品制備 樣品的固定 包埋和切片 染色 放射自顯影2.2.4、 電子顯微鏡 透射電子顯微鏡（transmission e

8、lectron microscope, TEM）原理： 以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50120KV)的平方根成反比。 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成。 分辨力0.2nm，放大倍數可達百萬倍。 用于觀察超微結構（ultrastructure），即小于0.2m、光學顯微鏡下無法看清的結構， 又稱亞顯微結構（submicroscopic structures）。制樣技術 超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二

9、醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。 負染技術 用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右。 冰凍蝕刻（freeze-etching） 亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。 掃描電子顯微鏡 20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。 分辨力為6-10nm，由于人眼的分辨力（

10、區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。 工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。 掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope，STM) 原理：根據隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外

11、加一電壓（2mV-2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向為0.1-0.2nm，縱向可達0.001nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。2.2 細胞化學技術2.2.1、 酶細胞化學技術通過酶的特異細胞化學反應來顯示酶在細胞內的定位。如： 金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。 Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。 聯苯胺反應：

12、過氧化酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。 脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。 茚三酮反應：顯示蛋白質。2.2.2、 免疫細胞化學技術（immunocytochemistry）利用免疫反應定位組織或細胞中抗原成分分布的一類技術。 免疫熒光技術（immunofluorescent technique）快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限 免疫電鏡技術，包括：免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術 應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等2.2.3、 其他細胞化學技術顯微光譜分析技

13、術 細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。 可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。2.3 細胞分選技術流式細胞術 用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。2.4細胞工程技術2.4.1、 細胞培養(yǎng)幾個概念

14、： 原代培養(yǎng)（primary culture）：即：培養(yǎng)直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉移到另外一個培養(yǎng)瓶稱為傳代或傳代培養(yǎng)（Passage） 細胞株（cell strain）：由單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法由單細胞增殖形成的細胞群稱細胞株(cell strain)。即通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養(yǎng)細胞。 細胞系（cell line）：原代培養(yǎng)物經首次傳代成功后即為細胞系(cell line)。 克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。 動物細胞培養(yǎng) 群體培養(yǎng)（mass culture）：將含有一定數量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層； 克隆培養(yǎng)（clonal culture）：培養(yǎng)高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆。 植物細胞培養(yǎng) 外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。 懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進行產業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產物。 原生質體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：比較容易攝取外來的遺傳物質，如DNA；便于進行細胞融合，形成雜交細胞；適宜條件下可產生細胞壁，經誘導分化成完整植株。 單倍體培養(yǎng)：通過