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1、一、概述,基本概念,干細胞分化發(fā)育,干細胞分類,干細胞的特點,胚胎性干細胞類型,干細胞,干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。包括胚胎干細胞和成體干細胞。干細胞的發(fā)育受多種內(nèi)在機制和微環(huán)境因素的影響。,（一）基本概念,干細胞,功 能,組織發(fā)生,全能干細胞,多能干細胞,專能干細胞,胚胎干細胞,組織干細胞,（二）干細胞分類,全能干細胞Totipotent stem cells,具有無限分化潛能的細胞。可以分化成人體的各種細胞，這些細胞構(gòu)成人體的各種組織器官。,八細胞階段,多能干細胞Multipotent stem cells,具有可分化出一種器官的多種組織潛能的干細胞，即能夠形成兩種或兩種以上

2、類型細胞的干細胞。具有自我增殖和分化兩種功能。,骨髓造血干細胞就是典型的多能干細胞，移植造血干細胞治療白血病、再生障礙性貧血等血液疾病。,專能干細胞,多能干細胞進一步分化成專能干細胞，只能分化成某一類型的細胞。又稱單能干細胞。 如表皮干細胞只能分化產(chǎn)生角化表皮細胞。,胚胎干細胞Embryonic stem (ES) Cells,來自早期胚胎、原始生殖細胞或畸胎瘤組織等源于胚胎的干細胞，其基本特性是具有穩(wěn)定地在體外自我更新、并穩(wěn)定地維持正常核型和發(fā)育全能或多能性、能分化為屬于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層范疇的各種類型分化細胞，甚至參與個體發(fā)育，又稱為萬能細胞(Multipotent stem cell

3、s )。,組織干細胞 Tissue-specific stem cell,指分布在成年生物體組織中負有構(gòu)建和補充某種組織細胞功能的干細胞。又稱為成體干細胞(Adult stem cells)。,（三）干細胞分化發(fā)育,干細胞的增殖速度一般比較慢。,一旦機體需要時，干細胞就可以進入分化過程，以適應(yīng)組織器官生長、發(fā)育和修復(fù)的需要，當(dāng)干細胞進入分化期時，其增殖速度開始逐漸加快。,干細胞增殖具有自穩(wěn)性，指干細胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定，這是干細胞區(qū)別于腫瘤細胞的本質(zhì)特征。,發(fā)育早期囊胚（受精后57天）中未分化的細胞。,囊胚含有約140個細胞，中心囊胚腔，腔內(nèi)一側(cè)為內(nèi)細胞群,可以發(fā)育成各種組織器官，具

4、有全能性。當(dāng)內(nèi)細胞群在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)時，稱之為胚胎干細胞。,胚胎干細胞繼續(xù)進行分化，形成專能干細胞,在胎兒、兒童和成人組織中的專能干細胞統(tǒng)稱為成體干細胞,在特定的外加條件下，一種組織的的成體干細胞可以“橫向分化”成其它組織的功能細胞。,干細胞分化為不同血細胞,（四）干細胞的特點,干細胞具有自我更新和分化潛能。,干細胞體積小，核質(zhì)比例大，端粒酶活性高，能無限增殖。,干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)。,干細胞通過兩種方式生長。,對稱分裂,非對稱分裂,兩種方式生長,形成兩個相同的干細胞。,調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，一個子細胞不可逆的走向分化終端成為功能專一的分化細胞；另一個保持親代的

5、特征，仍作為干細胞保留下來。,（五）胚胎干細胞類型,胚胎干細胞,全能性胚胎性干細胞,多能性胚胎性干細胞,在胚胎發(fā)育最早階段，各個卵裂球發(fā)育潛能幾乎是等同的，每個細胞可獨立地產(chǎn)生完整的機體；,能誘導(dǎo)分化為幾乎所有類型的細胞，具有很強的生物學(xué)可塑性，已屬于多能性，略強于組織干細胞。,組織來源,胚胎性癌細胞，EC embryonal carcinoma cell,全能性胚胎干細胞，ESembryonic stem cell,多能性胚胎干細胞，EG embryonic germ cell,二、ES細胞和EG細胞培養(yǎng)建系技術(shù),飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,胚胎細胞來源,ES細胞和EG細胞的培養(yǎng)過

6、程,ES細胞和EG細胞系的特性和鑒定,體外培養(yǎng)建系ES細胞和EG細胞的技術(shù)以小鼠最為成熟，成功率最高。,培養(yǎng)原則是有賴于獲得全能性胚胎細胞或細胞團，并建立體外適合其增殖和抑制分化的培養(yǎng)系統(tǒng)。,早期胚胎細胞離體后極易發(fā)生分化，解決阻止其分化、確保維持其全能性或多能性是關(guān)鍵。,分化抑制物,飼養(yǎng)層細胞（feeder layer）,特殊細胞的條件培養(yǎng)液（conditioned medium）,分化抑制因子（differentiation inhibitory factor，DIF）,體外培養(yǎng)ES和EG細胞兩大方法,飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,原代或初期培養(yǎng)階段一般都需要依賴于能分泌必需生長因

7、子的飼養(yǎng)層細胞。,以添加LIF生長因子或某些特定細胞的條件培養(yǎng)液至含F(xiàn)CS的正常培養(yǎng)液，來替代飼養(yǎng)細胞。,（一）飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,常用的飼養(yǎng)層細胞,MEF細胞,STO細胞,取自各種品系小鼠的12dpc的胚胎，經(jīng)剪碎和胰蛋白酶消化，常規(guī)分離細胞培養(yǎng)為單層散布的成纖維細胞。經(jīng)絲裂霉素C處理終止細胞分裂后，用作ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層。,來自SIM小鼠（S）胚胎的對硫代鳥嘌呤（tyioguanine,T）和烏本苷（ouabain,O）有抗性的成纖維細胞系，主要分泌干細胞生長因子（SCF）和白血病抑制因子（LIF）。,用作ES細胞或EG細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層的MEF或STO細胞均需用10mg/L絲裂霉素C在37

8、處理4h，用前經(jīng)PBS徹底洗滌。,（二）無飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法,小鼠ES細胞培養(yǎng)液,直接在ES細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入重組LIF；,Buffalo大鼠肝細胞條件培養(yǎng)液（BRLCM）；,23周幼年大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液（RHCM）。,無飼養(yǎng)層的ES細胞培養(yǎng)系統(tǒng),23份細胞條件培養(yǎng)液12份新鮮的ES細胞培養(yǎng)液10%20%胎牛血清,在胚胎干細胞原代和建系初期，培養(yǎng)ES/EG細胞的成功率不高，還需補充適當(dāng)?shù)纳L因子。建系成功后，可使用無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。,不同種屬的ES/EG細胞對生長因子的要求不同，如人ES細胞不能和LIF起反應(yīng)，難以抑制人ES細胞的分化。,（三）胚胎細胞來源,不同胚胎發(fā)育速度和方式存在較大差異

9、。,小鼠多用34天的胚泡或23天的桑椹胚，,豬取810天的胚泡，,綿羊取89天的胚泡，,人和牛取78天的胚泡。,體外授精胚胎或重構(gòu)胚胎在體外培養(yǎng)至所需發(fā)育階段時，也是ES細胞培養(yǎng)的有效材料來源。,小鼠采用超排卵途徑收集胚胎,雌性成年小鼠注射5U孕馬血清促性腺激素（MPS），48h后再注射5U人絨毛膜促性腺激素（HCG）；,與雄鼠合籠，自然交配，陽性者為0天（即0.5dpc）；,第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分別剖取孕鼠子宮，沖出早期胚泡，進一步分離培養(yǎng)建立ES細胞系；,剖取發(fā)育至8.5 dpc10.5 dpc時的胚胎，可建立小鼠EG細胞系。,人早期胚胎和生殖腺采集,新鮮或

10、冷凍保存的受精卵或卵裂期人胚培養(yǎng)至胚泡期，進一步分離ICM細胞，可建立人ES細胞系；,經(jīng)人流途徑獲取78天胚泡或59周胚胎的生殖腺，從中分別分離和培養(yǎng)人ES和EG細胞系。,（四）ES細胞和EG細胞的培養(yǎng)過程,ES細胞的培養(yǎng)過程,基本培養(yǎng)液,DMEM液 15%20% FCS0.1mmol/L巰基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素,將胚泡接種于預(yù)先鋪有作為滋養(yǎng)層而無有絲分裂活性的單層MEF細胞的培養(yǎng)皿中,用免疫手術(shù)法分離胚泡的ICM細胞，或用常規(guī)培養(yǎng)法分離出ICM細胞進一步培養(yǎng)。,培養(yǎng)23天,免疫手術(shù)法,44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的滋養(yǎng)外層胚層和未分化的ICM細胞組成，前者細胞

11、表面一般已表達主要組織相容性復(fù)合體（MHC），能識別其相應(yīng)抗體和形成免疫復(fù)合物，在補體存在時可導(dǎo)致細胞發(fā)生免疫溶解。具體操作如下：,體外培養(yǎng)的胚泡，用酸性Tyrodes液（pH2.5）處理，去除透明帶；,Hanks洗滌，加入兔抗JCR小鼠脾臟細胞抗血清（抗H2b）；,移至含新鮮豚鼠血清的培養(yǎng)液，,Hanks液洗滌后，移至96孔鋪有MEF或STO飼養(yǎng)層細胞和DMEM基本培養(yǎng)液的板內(nèi)進一步培養(yǎng)。,30min,胚泡的滋養(yǎng)外胚層細胞呈泡狀，發(fā)生免疫溶解；而ICM細胞不具H2b抗原，細胞完整；,30min,常規(guī)培養(yǎng)法,未去透明帶的胚泡培養(yǎng)34天，ICM細胞團從貼壁胚泡內(nèi)長出來；,胰蛋白酶和EDTA混合消

12、化液在37消化5min；,解離的細胞團移至滋養(yǎng)層的24孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)4天，可在一些孔內(nèi)見到巢狀胚胎干細胞團；,胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細胞團并繼續(xù)培養(yǎng)，克隆和純化ES細胞。,視ES細胞巢密度轉(zhuǎn)移到較大容積的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶。,EG細胞的培養(yǎng)過程,哺乳動物原始生殖細胞（PGC）最早發(fā)生于近尿囊基部的卵黃內(nèi)胚層內(nèi)，隨著胚胎發(fā)育和縱向轉(zhuǎn)折，卵黃囊的一部分成為胚胎的后腸，PGC取材主要根據(jù)其在不同物種的早期胚胎中所處遷移位置而定。,1、原始生殖細胞的分離和原代培養(yǎng),收集8.510.5dpc小鼠胚胎，用DHanks液輕洗后，在解剖鏡下用鑷子剖取包含原始生殖細胞（PGC）的生殖嵴組織；,以0.02%EDT

13、A液孵育含PGC細胞的生殖嵴組織，37,15min；,吸管輕吹打散，接種于鋪有滋養(yǎng)層的4孔培養(yǎng)板內(nèi)。,基本培養(yǎng)液,DMEM液 15%20% FCS0.1mmol/L巰基乙醇50U/ml青霉素、50ug/ml鏈霉素2mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉,2、滋養(yǎng)層細胞,宜用8代以內(nèi)的小鼠MEF細胞或STO細胞系。,用前經(jīng)10ug/ml絲裂霉素C在37處理23h；,接種于包被0.1%明膠的培養(yǎng)板或細胞瓶內(nèi)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM。,3、EG細胞純化和建系,培養(yǎng)物在滋養(yǎng)層細胞上分裂增殖，46天后在顯微鏡下將包含原始生殖細胞的細胞團用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至新滋養(yǎng)層細胞上增殖；,重復(fù)用

14、胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至新的滋養(yǎng)層細胞，經(jīng)過23次過程，一般可產(chǎn)生巢狀（nests）生長的干細胞集落；,最后將它轉(zhuǎn)移到鋪有滋養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)進一步擴增，此時培養(yǎng)液中可減少或省略LIF、SCF和bFGF等生長因子。,（五）ES細胞和EG細胞系的特性和鑒定,1形態(tài)學(xué)特征,將克隆挑出，用胰蛋白酶消化并接種于新的滋養(yǎng)層或特定的條件培養(yǎng)液中，培養(yǎng)34天后，分散的細胞又重新呈島狀或巢狀的細胞克隆。,圓形或卵圓形，彼此均呈單層或多層緊密堆積而形成島狀或巢狀群體生長形態(tài)；,呈現(xiàn)一個或幾個核仁、核質(zhì)比例高；,不同種的ES細胞形態(tài)學(xué)特征有所不同。,人體ES細胞呈扁平狀群落，而且細胞界限清楚；,小鼠ES細胞或EG細胞

15、雖然聚集成團，但呈懸浮狀態(tài)，細胞界限也較清楚；,豬ES細胞具有特征性細胞骨架蛋白表達的上皮細胞表型。,2、發(fā)育全能性和分化潛能鑒定,免疫組織化學(xué),時期專一性胚胎抗原（SSEA）,堿性磷酸酶（AKP）,Oct4基因表達,端粒酶（telomerase）,體外分化潛能,體內(nèi)分化,時期專一性胚胎抗原（stage-specific embryonic antigen, SSEA）,間接免疫熒光法檢測ES和EG細胞表面抗原。不同種屬具有亞型，小鼠SSEA1型，人SSEA3或SSEA4亞型。,堿性磷酸酶（AKP）,小鼠胚胎干細胞中活性較高，已分化細胞中活性明顯降低。細胞經(jīng)1%多聚甲醛固定，直接用AKP底物N

16、BT液染色，未分化細胞具有較高的AKP酶活性，顯示深藍紫色。,Oct4基因表達,Oct4是生殖系專一性轉(zhuǎn)錄因子，在小鼠胚胎發(fā)育早期、生殖細胞譜系以及體外培養(yǎng)的多能干細胞是特異性表達的標志基因；人類ES、EG細胞中Oct4的表達情況尚不明確。,端粒酶（telomerase）,端粒酶是一類核糖核蛋白，與控制細胞壽命有關(guān)。人ES細胞的端粒酶活性特別高，分化細胞一般難以檢測到其活性。,體外分化潛能,將ES細胞和EG細胞接種于缺乏滋養(yǎng)層細胞和LIF生長因子培養(yǎng)液的瓊脂板上，或添加適當(dāng)?shù)姆只T導(dǎo)物質(zhì)（如維甲酸），或懸滴培養(yǎng)，細胞黏附成團；,培養(yǎng)34天后形成擬胚體，最外層分化為較大細胞組成的內(nèi)胚層樣結(jié)構(gòu)，中間為未分化的干細胞；,培養(yǎng)810天，擬胚體增大，內(nèi)部出現(xiàn)囊腔，形成囊狀胚體，這樣的結(jié)構(gòu)可持續(xù)3周左右。,體內(nèi)分化,不同品系小鼠的ES細胞和EG細胞在體內(nèi)生長速度和分化能力會有所區(qū)別。,接種于同一品系的小鼠或免疫缺損小鼠腹股溝、眼窩和腹腔，可形成由內(nèi)胚層、中胚層和外胚層構(gòu)成的畸胎瘤，通達組織學(xué)檢查，可以分析ES細胞或EG細胞的全能性或多能性或限能性的發(fā)育潛能。,三、ES細胞和EG細胞體外誘導(dǎo)分化,基