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1、第2章 酶的生產(chǎn)與分離純化,主要內(nèi)容： 2.1 酶的發(fā)酵生產(chǎn)* 2.2 提高酶發(fā)酵產(chǎn)量的方法 2.3 食品用酶發(fā)酵生產(chǎn)舉例 2.4 酶分離純化工作的基本原則 2.5 酶的純化* 2.6 酶純度的評價 2.7 酶的劑型與保存,1,2.1 酶的發(fā)酵生產(chǎn),目前，酶的生產(chǎn)主要通過三種方法：組織提?。耗竟系鞍酌浮⒛榈鞍酌赴l(fā)酵生產(chǎn)：最大量的來源化學(xué)及生物合成：生物重組其中，酶的發(fā)酵生產(chǎn)生目前生產(chǎn)酶的主要方法。,2,酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作控制，利用細(xì)胞（包括微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞）的生命活動，產(chǎn)生人們所需要酶的過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。,3,能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備如下幾個條件

2、：（1）產(chǎn)酶量高（2）容易培養(yǎng)和管理 （3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好（4）利于酶的分離純化（5）安全可靠,4,2.1 酶的發(fā)酵技術(shù),利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點是：(1) 微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2) 微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3) 微生物培養(yǎng)基來源廣泛、價格便宜。(4) 可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動化，經(jīng)濟效益高。(5) 可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開發(fā)新酶種。因此，下面將主要介紹微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶的一般原理和工藝。,5,2.1.1 產(chǎn)酶微生物,菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的重要條件。菌種不僅與產(chǎn)酶種類、產(chǎn)量密

3、切相關(guān)，而且與發(fā)酵條件、工藝等關(guān)系密切。已經(jīng)在自然界中發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的酶約有5060種。它們的生產(chǎn)菌種十分廣泛，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌。,6,（1）枯草芽孢桿菌細(xì)菌屬革蘭氏陽性菌落粗糙，不透明此菌用途廣，可用于生產(chǎn)-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶，堿性磷酸酶等。,7,革蘭氏染色是微生物中重要的染色方法 1、初染：結(jié)晶紫染色 2、媒染：碘液媒染 3、脫色：乙醇脫色 4、復(fù)染：番紅復(fù)染,8,細(xì)菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫碘的復(fù)合物，增強染料與細(xì)菌的結(jié)合力。

4、當(dāng)用脫色劑處理時，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細(xì)胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔經(jīng)縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。,9,（2） 大腸桿菌革蘭氏陰性，無芽孢菌落光滑用于谷氨酸脫羧酶，天門冬氨酸酶等胞內(nèi)酶,10,（3）黑曲霉屬于真菌屬，菌絲體由橫隔的分枝菌絲構(gòu)成，菌叢呈黑褐色糖化酶、淀粉酶

5、、酸性蛋白酶、果膠酶等。,11,（4） 米曲霉真菌屬，菌叢一般由黃綠色變?yōu)辄S褐色。產(chǎn)分生孢子主要用于糖化酶和蛋白酶的生產(chǎn),12,（5）根霉由營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生匍匐枝，匍匐枝的末端產(chǎn)生假根，并生長出成群孢子囊梗。主要用于糖化酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶等生產(chǎn),13,（6）毛霉菌絲體上生出孢子囊梗，孢子囊梗頂端有膨大成球形的孢子囊。主要用于生產(chǎn)蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。,14,（7）鏈霉菌放線菌氣生菌絲和基內(nèi)菌絲葡萄糖異構(gòu)酶。青霉素?；?、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等,15,（8）啤酒酵母細(xì)胞呈圓形，卵形、橢圓形到臘腸形。菌落呈白色，有光澤、平滑。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶、丙酮酸脫羧酶等。,16,2.1.1.2 產(chǎn)酶菌株的

6、選育特定酶產(chǎn)生菌的篩選方法主要依據(jù)酶催化的反應(yīng)性質(zhì)、作用底物的特異性、底物和產(chǎn)物的特性以及酶在細(xì)胞中所處的位置來進(jìn)行選育。對于胞外酶，可在培養(yǎng)基中加入酶作用的不溶性底物或酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物，根據(jù)菌落周圍的透明圈、顏色變化來篩選。對于胞內(nèi)酶，若酶作用底物分子量小可透過細(xì)胞膜，將酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物作為底物，加在培養(yǎng)基中，根據(jù)菌落顏色變化來篩選。而多數(shù)胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選則通過細(xì)胞破碎物做酶源，經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點來篩選（輔酶NAD）。,17,酶的發(fā)酵生產(chǎn)是以獲得大量所需的酶為目的。因此，除了選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物，還應(yīng)對酶的發(fā)酵加以控制。酶的發(fā)酵技術(shù)內(nèi)容包括培養(yǎng)基設(shè)計、選擇合適的發(fā)酵方式及

7、發(fā)酵過程的各種參數(shù)控制等。酶的發(fā)酵的生產(chǎn)一般工藝如圖所示：,2.1.2 酶的發(fā)酵技術(shù),重要,18,保藏細(xì)胞,細(xì)胞活化,細(xì)胞擴大培養(yǎng),原生質(zhì)體,固定化細(xì)胞,固定化原生質(zhì)體,預(yù)培養(yǎng),發(fā)酵,發(fā)酵,分離純化,酶,重要,19,2.1.2.1 培養(yǎng)基培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。,重要,20,氨基酸結(jié)構(gòu)通式,C,COOH,H,R,NH2,21,（1）碳源碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動的能量的主要來源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機碳的異養(yǎng)型微生物。,重要,吃點啥？,22

8、,重要,有機碳的主要來源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。此外，以石油產(chǎn)品中1216碳的成分來作碳源，如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶，均已獲得成功。,23,不同的細(xì)胞對各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。,重要,

9、24,（2）氮源氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機氮源和無機氮源兩種，常用的有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。,重要,25,不同的細(xì)胞對各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來說，動物細(xì)胞要求有機氮；植物細(xì)胞主要要求無機氮；微生物細(xì)胞中，異養(yǎng)型微生物用有機氮，自養(yǎng)型用無機氮。多數(shù)情況下將有機氮源和無機氮源配合使用才能取得較好的效果。,重要,我有我要求,26,例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只

10、用銨鹽或硝酸鹽為氮源時，酶產(chǎn)量僅為有胨時的30%。只用有機氮源而不用無機氮源時產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機氮源外尚需添加1%3%的無機氮源。,重要,27,（3） 無機鹽微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。提供細(xì)胞生命活動，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH、氧化還原電位和滲透壓。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無Ca2+存在時灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時穩(wěn)定pH范圍可以擴大到57。,重要,28,鈉離

11、子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時，添加100 ppm Co2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%80%。微量元素如過量會引起不良效果。,重要,29,（4）生長因子 微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì)，才能正常生長發(fā)育，這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉

12、米漿中一般含有生長素32128mg / mL。,重要,有你才健康！,30,（5） 產(chǎn)酶促進(jìn)劑 產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫80的濃度為0.1 %時能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護酶的活性。,重要,31,2.1.2.2 細(xì)胞活化與擴大培養(yǎng)細(xì)胞活化是指保藏細(xì)胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力。為了保證發(fā)酵時有足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞，活化了的細(xì)胞一般要經(jīng)過一級至

13、數(shù)級的擴大培養(yǎng)。,32,2.1.2.3 發(fā)酵方式的選擇 酶的種類繁多，產(chǎn)酶菌種各異，但其發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程是相似的，一般有固態(tài)發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法之分，具體采用何種方法由微生物和酶的種類來決定。,33,2.1.2.4 發(fā)酵條件的控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。,34,(1) pH對產(chǎn)酶的影響種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，微生物不斷分解和同化營養(yǎng)物質(zhì)，同時排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。,35,一般來說，

14、培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對產(chǎn)酶帶來不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C / N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過高時用糖或淀粉來調(diào)節(jié)，pH過低時，通過氮調(diào)節(jié)。,36,(2) 溫度對產(chǎn)酶的影響 發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營養(yǎng)成分來合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)

15、基中的營養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來的熱量，這時，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。,37,微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37 ，霉菌和放線菌為2830 ，一些嗜熱微生物需在4050 下生長繁殖，如紅曲霉生長溫度3537，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為3740 。,38,在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.3

16、98進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時，培養(yǎng)溫度必須從31 逐漸升溫至40 ，然后再降溫到31進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報道，酶生產(chǎn)的溫度對酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行淀粉酶生產(chǎn)時，在55 培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35 好。,39,(3)耗氧量和通風(fēng)量對產(chǎn)酶的影響其實通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來說，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風(fēng)量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。,40,(4) 攪拌的影響對于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異，由于