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1、精品文檔,第四章 酶的分離與純化,一、酶的分離二、酶的精制三、電泳四、酶的濃縮五、酶結(jié)晶,精品文檔,精品文檔,一般程序1. 預(yù)處理和固液分離：加速固液相分離2. 細(xì)胞破碎分離胞內(nèi)產(chǎn)物3. 初步純化（提取）：除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)4. 高度純化（精致）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)5. 產(chǎn)品加工,精品文檔,一、酶的分離,（一）發(fā)酵液預(yù)處理目的：改變發(fā)酵液物理性質(zhì)盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中去除部分雜質(zhì),精品文檔,1、發(fā)酵液的相對純化,（1）無機(jī)離子的去除Ca2+ 常用草酸Mg2+ 三聚磷酸鈉，生成可溶性絡(luò)合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+Fe3+ 黃

2、血鹽K4Fe(CN)6,形成普魯(Fe4Fe(CN)63)沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12K+,精品文檔,(2)雜蛋白質(zhì)的去除,1）沉淀法 機(jī)理主要是破壞電荷。酸性溶液中與一些陰離子如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸等形成沉淀。堿性溶液中與一些陽離子如Ag2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Pb2+等形成沉淀2）變性法 蛋白質(zhì)因變性導(dǎo)致溶解度下降而被除去。常見的如加熱、大幅度調(diào)pH、加有機(jī)溶劑和表面活性劑等。3）凝聚和絮凝 用Al2(SO4)3等凝聚劑使蛋白質(zhì)膠體體系不穩(wěn)定，通過相互碰撞發(fā)生凝集。形成的顆粒較細(xì)。 絮凝作用是指在某些高分子絮凝劑（如聚丙烯酰胺類衍生物

3、）的架橋作用下將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團(tuán)的過程。形成的顆粒較粗，用量小，速度快。4) 吸附法,精品文檔,(3)色素及其他物質(zhì)的去除,活性炭：0.1-1.5%離子交換樹脂 如DEAE-纖維素從含酶溶劑中吸附色素物質(zhì)時，可同時去除非活性蛋 白質(zhì),2、發(fā)酵液的固-液分離離心和過濾,菌種對過濾速度影響很大 真菌容易過濾，放線菌則難 培養(yǎng)基組成對過濾也有影響,精品文檔,（二）細(xì)胞破碎,1、細(xì)胞壁與細(xì)胞破碎2、細(xì)胞破碎的方法1）機(jī)械法：珠磨法（bead mill）實驗室：Mickle搗碎機(jī)；中試：膠質(zhì)膜處理；工業(yè)：高速珠磨機(jī)高壓勻漿法：大規(guī)模細(xì)胞破碎方法；對于酵母等難破碎及高濃度細(xì)胞可采用

4、多次循環(huán)方法；絲狀真菌、較小的G+菌，含有包含體（Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。超聲波法（Ultrasonication）：桿菌比球菌容易破碎； G-比 G+容易破碎；酵母菌不易破碎；實驗室較常用的方法，樣品溫度？,精品文檔,2）非機(jī)械法：酶法、化學(xué)法、物理法化學(xué)滲透法（chemical permeation）：改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性；TritonX-100：結(jié)合、溶解磷脂，破壞膜脂雙層；EDTA：對G-菌外膜有破壞作用；有機(jī)溶劑：分解細(xì)胞壁中的脂類；變性劑：脲、鹽酸胍與水中氫鍵作用。優(yōu)點：選擇性，易于固液分離。缺點：通用性差，效率低，毒性,精品文檔,JJ-2組織搗

5、碎勻漿機(jī),精品文檔,ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī),精品文檔,（三）酶的提?。╡xtraction）,1、鹽溶液提?。蝴}溶（salting in） 在低濃度鹽溶液中，酶的溶解度增加。常用稀鹽溶液（0.02-0.5mol/L）。2、酸、堿溶液提取3、有機(jī)溶劑提取,精品文檔,（四）離心分離,1、離心機(jī)種類(1)常速離心機(jī) 最大轉(zhuǎn)速8000 r/min,相對離心力（RCF)1104g(2)高速離心機(jī) 1104 r/min轉(zhuǎn)速2.6104 r/min, 8103gRCF1105g(3)超速離心機(jī) 轉(zhuǎn)速2.5104 r/min, RCF1105g,精品文檔,TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī),精品文檔,2、

6、離心分離方法（1）差速離心(differential centrifugation)（2）密度梯度離心(density gradient centrifugation)（3）等密度梯度離心(sendimentation equilibrium centrifugation)3、離心條件（1）離心力 相對離心力RCF=1.1210-5rn2g（2）離心時間（3）溫度和pH,精品文檔,用差速離心法分離亞細(xì)胞成分,精品文檔,精品文檔,精品文檔,（五）沉淀分離1、鹽析法 鹽溶(salting in) 在低濃度鹽溶液中，酶的溶解度增加。 鹽析(salting out) 鹽濃度升高到一定程度，蛋白質(zhì)和酶濃

7、度隨鹽濃度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）鹽析法的機(jī)制 （2）鹽析用中性鹽的選擇 常用的中性鹽：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4飽和度表示法 （4）影響鹽析的因素 1）蛋白質(zhì)濃度 2）pH和溫度的影響,精品文檔,精品文檔,蛋白質(zhì)的鹽析,精品文檔,鹽析應(yīng)用最廣泛的是硫酸銨,優(yōu)點 1）溶解度大 25時硫酸銨的溶解度可達(dá)4.1mol/L(541g/L)以上。大約每升水可溶解767g之多。在這一高溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以被鹽析沉淀出來。 2）溫度系數(shù)小 硫酸銨的溶解度受溫度影響不大。例如0時，硫酸銨的溶解度仍可達(dá)到3.9mol/L

8、(515g/L)。大約每升水可溶解676g。對于需要在低溫條件下進(jìn)行酶的純化來說，應(yīng)用硫酸銨是有利的。 3）硫酸銨不易引起蛋白質(zhì)變性，對于很多種酶還有保護(hù)作用，且價格低廉，容易獲得。缺點 銨離子干擾雙縮脲反應(yīng)，為蛋白質(zhì)的定性分析造成一定困難。,精品文檔,(NH4)2SO4飽和度表,精品文檔,溫度是影響蛋白質(zhì)溶解度的重要因素。在無鹽或稀鹽溶液中，溫度低，蛋白質(zhì)溶解度也低；在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小。許多蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度溶液中，25時的溶解度比0時明顯減小。這主要是因為蛋白質(zhì)分子在水化時要吸熱，失水時則放熱，溫度升高有利于蛋白質(zhì)失水沉淀。一般鹽析時不要降低溫度，除非這種酶對

9、溫度比較敏感。鹽析pH的選擇以不降低酶的活性為原則，通常通過試驗選擇酶穩(wěn)定的pH范圍進(jìn)行鹽析。,精品文檔,鹽析法的優(yōu)點：操作簡便、使用廣泛、去雜純化效果好。濃縮作用，有利于進(jìn)一步純化。 缺點：分辨能力差，純化倍數(shù)低。得到的蛋白質(zhì)或酶含大量鹽粉，需脫鹽后進(jìn)一步純化。,精品文檔,2、有機(jī)溶劑法 利用酶等蛋白質(zhì)在水溶性有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇和丙酮）中溶解度降低而使之分離的方法。（1）有機(jī)溶劑沉淀法的機(jī)理 1）主要效應(yīng)是降低水溶液的介電常數(shù)(dielectric constant)。介電常數(shù)用于衡量絕緣體儲存電能的性能。介電常數(shù)代表了電介質(zhì)的極化程度，也就是對電荷的束縛能力，介電常數(shù)越大，對電荷的束縛

10、能力越強(qiáng)。帶電離子基團(tuán)之間的作用力隨介電常數(shù)的減小而增大。帶電溶質(zhì)便互相吸引凝集而沉淀。（ 20時介電常數(shù)：水80，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4 ） 2）破壞蛋白質(zhì)表面水膜，而使蛋白質(zhì)聚集沉淀。 3）作為變性劑，破壞蛋白質(zhì)氫鍵等化學(xué)鍵。,精品文檔,有機(jī)溶劑沉淀法 優(yōu)點：分辨率高；密度低，便于離心分離；沉淀不需脫鹽；溶劑易于蒸發(fā)除去，適于食品工業(yè)用酶制劑的制備。 缺點：容易使酶變性失活；安全要求較高；操作必須在低溫下進(jìn)行。,精品文檔,（2）有機(jī)溶劑的選擇和用量 與水互溶有機(jī)溶劑包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和丙酮有一定毒性。沉淀能力順序是丙酮乙醇甲醇。工業(yè)上多用乙醇作為沉淀劑。（3）影響有機(jī)

11、溶劑沉淀的因素 1）溫度 2）pH 3）離子強(qiáng)度 4）蛋白質(zhì)濃度3、等電點法(isoelectric precipitation)4、其他沉淀法,精品文檔,（六）萃取分離(extraction)概念:P1541、溶劑萃取法 比沉淀分離程度高,比離子交換法選擇性好, 傳質(zhì)速度快,生產(chǎn)周期段,便于連續(xù)操作,容易實現(xiàn)自動化.2、雙水相萃取法(Partion of two aqueous phase extraction) 用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液進(jìn)行萃取.3、超臨界流體萃取法4、反膠團(tuán)萃取法,精品文檔,雙水相萃取法,雙水相：將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混和時，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值

12、，體系會自然地分成互不相溶的兩相。如：當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉的水溶液混合時，就得到一個渾濁不透明的溶液，它隨之分成兩個液相，這就是雙水相體系。用于生物分離的高聚物體系有：聚乙二醇(簡稱PEG)葡聚糖(簡稱Dextran)和PEGDextran硫酸鹽體系。常見的高聚物無機(jī)鹽體系為：PEG硫酸鹽或磷酸鹽體系。原理：生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。(酶、蛋白質(zhì)等生物大分子的分配系數(shù)大致在0.1-10之間)。,精品文檔,各種雙水相系統(tǒng),精品文檔,雙水相系統(tǒng)的應(yīng)用,精品文檔,二、酶的精制,根據(jù)原理,酶的純化方法分為: 1)沉淀法;2)相分配法;3)柱層析法;4)電泳或離心法。酶純化的基本原則

13、: 1)建立方便靈敏的分析方法; 2)選擇有效的純化方法; 3)盡量避免變性; 4)盡量避免過度暴露于空氣中.,精品文檔,酶的理化性質(zhì)與分離純化方法,精品文檔,（一）膜分離 原理 利用溶液中溶質(zhì)分子的大小、形狀、性質(zhì)等的 差別,對于各種薄膜表現(xiàn)出不同的可透性而達(dá)到分離的目 的。 膜分離技術(shù)分為反滲透(RO)、超濾(UF)、納濾(NF)、 微濾(MF)。主要區(qū)別在于膜孔徑的大小。酶純化中常用的 是超濾和微濾,特別是濃縮和脫鹽。,精品文檔,幾種膜分離技術(shù)特點,精品文檔,1、透析(dialysis) 原理 P159 1)透析膜 纖維素或其衍生物制成。透析袋已經(jīng)商品化。 2)透析袋預(yù)處理 3)透析方法

14、及裝置 2.超濾 原理 P164-165 利用具有一定孔徑的微孔濾膜，對生物大分子溶液進(jìn)行過濾（常壓、加壓或減壓），使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而達(dá)到脫鹽、更換緩沖液或濃縮的目的。這種利用超濾膜過濾分離大分子和小分子物質(zhì)的方法叫做超濾法。超濾膜的截留分子量范圍從5000到500000。,精品文檔,透析方法示意圖,超濾工作示意圖,精品文檔,精品文檔,精品文檔,（二）凝膠過濾法(gel filtration),1、原理,精品文檔,精品文檔,2、凝膠的種類,1.,精品文檔,交聯(lián)葡聚糖凝膠結(jié)構(gòu)的示意圖,精品文檔,葡聚糖凝膠的種類和規(guī)格,精品文檔,精品文檔,精品文檔,3、

15、凝膠過濾技術(shù)4、凝膠過濾技術(shù)的應(yīng)用,精品文檔,（三）離子交換層析(Ion Exchange Chromatography,IEC),1、原理,精品文檔,精品文檔,離子交換吸附洗脫示意圖,精品文檔,2、離子交換劑,精品文檔,3、離子交換技術(shù)：P182,精品文檔,（四）疏水層析(Hydrophobic Chromatography),1、原理 一些疏水性較強(qiáng)的介質(zhì)對疏水性較大的蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用，而且吸附后不容易被洗脫下來。盡管多數(shù)蛋白質(zhì)都溶于水，具有較強(qiáng)的親水性，但實際上分子內(nèi)部都存在著一個疏水核心中心，分子構(gòu)象十分復(fù)雜。分子內(nèi)部都不同程度存在著一些疏水基團(tuán)或疏水中心區(qū)。如蛋白質(zhì)表面含有某些

16、非極性氨基酸側(cè)鏈，其中包括Leu、Phe、Trp、Ala、Pro等氨基酸，這些非極性氨基酸側(cè)鏈組成了蛋白質(zhì)疏水核心中心，決定了蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)。P188,精品文檔,2、疏水層析介質(zhì)：P1883、疏水層析技術(shù)：P189,精品文檔,（五）吸附層析(Absorption Chromatography),1、原理 液一固吸附層析是運用較多的一種方法，特別適用于很多中等分子量的樣品（分子量小于1，000的低揮發(fā)性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分。一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)這三個因素。,精品文檔,2、吸附介質(zhì) 常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。 （1）硅膠：層析用硅膠為一多孔性物質(zhì)，分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu)，同時在顆粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17，吸附力極弱不能用作為吸附劑。,精品文檔,（2）活性炭： 使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸