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1、第三章第三章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化 電泳電泳（electrophoresis,EPelectrophoresis,EP）：指帶電粒子：指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動的過程。極方向移動的過程。電電泳泳技技術(shù)術(shù)是是根根據(jù)據(jù)各各種種帶帶電電粒粒子子在在電電場場中中遷遷移移速速度度的的不不同同而而對對物物質(zhì)質(zhì)進(jìn)進(jìn)行行分分離離的的實(shí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。驗(yàn)技術(shù)。第四節(jié)第四節(jié) 電電 泳泳1一、電泳的基本理論一、電泳的基本理論 1.1.原理原理:在一定在一定pHpH條件下條件下（用（用bufferbuffer），），不同大小、不同大小、形狀及

2、帶電顆粒在電場中的移動速度不同形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。成緊密的泳動帶。+-2 影響影響遷移率遷移率的因素：的因素：顆粒性質(zhì)：顆粒性質(zhì)：Q Q越大、越大、r r越小、形狀越接近球形，越小、形狀越接近球形，v v 越快。越快。電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度：E E越高，越高，v v越快。越快。電泳液：電泳液：pH pH值：離值：離pIpI越遠(yuǎn)，越遠(yuǎn)，v v越快。越快。（用（用bufferbuffer保持恒定）保持恒定）離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高，v v 越低。越低。通常，緩沖

3、液離子強(qiáng)度在通常，緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.20.02-0.2之間。之間。電電 滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。滲：在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。3 自由界面電泳：自由界面電泳：又稱移動界面電泳又稱移動界面電泳，指在沒指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳:指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散。防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散。2.2.電

4、泳的分類電泳的分類4按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳：用濾紙作支持介質(zhì)，用于核苷酸定性定量分析。紙電泳：用濾紙作支持介質(zhì)，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，醋酸纖維素薄膜電泳：常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。v以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。5瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂

5、糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率高。用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率高。v聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。6 3.3.電泳常用設(shè)備電泳常用設(shè)備（1 1）電泳儀電泳儀 ：提供穩(wěn)定直流電源的裝置：提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。常壓電泳儀（常壓電泳儀（600V600V）高壓電泳儀（高壓電泳儀（3000V300

6、0V）超高壓電泳儀（超高壓電泳儀（30000V30000V50000V50000V）（2 2）電泳槽電泳槽：自由界面電泳槽自由界面電泳槽 管狀電泳槽管狀電泳槽 板狀電泳槽板狀電泳槽（3 3）附屬設(shè)備：附屬設(shè)備：7二、聚丙烯酰胺凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳！聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。81.1.原理原理 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體聚丙烯

7、酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（AcrAcr）和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（BisBis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。在催化劑和加速劑作用下聚合的。9CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2

8、 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis10 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1 1）化學(xué)催化系統(tǒng)：）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMEDAP-TEMED 催化劑：過硫酸銨催化劑：過硫酸銨（ammonium persulfateammonium persulfate，APAP）加速劑：加速劑：TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）2 2）光催化系統(tǒng)：核黃素光

9、（）光催化系統(tǒng)：核黃素光（TEMEDTEMED）催化劑催化劑:核黃素核黃素（維生素（維生素B B2 2）引發(fā)劑引發(fā)劑:光光 TEMED TEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。.11 凝膠濃度越大凝膠濃度越大（?。?，（?。?，孔徑越小孔徑越小（大），（大），可可分離分子量較小分離分子量較?。ù螅ù螅┑念w粒。的顆粒。Acr Acr與與Bis的重量比應(yīng)在的重量比應(yīng)在30左右。左右。凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系12樣品樣品分子量（分子量（DaDa）適宜的凝膠濃度（）適宜的凝膠濃度（）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)105510105 52020303015152020101

10、015155 510102 25 5聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表132.2.分離效應(yīng)分離效應(yīng) PAGE PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳連續(xù)電泳 采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳 采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)不連續(xù)不連續(xù)PAGE PAGE 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 連續(xù)連續(xù)PAGEPAGE14 電荷效應(yīng)電荷效應(yīng):分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。遷移率不同。分子篩效應(yīng)：分子篩

11、效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率?，F(xiàn)出不同的遷移率。濃縮效應(yīng)：濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。窄帶，然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。15不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：1.1.凝膠分上、下兩層，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔凝膠分上、下兩層，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。徑的分離膠。2.2.緩沖液離子組成及各層凝

12、膠的緩沖液離子組成及各層凝膠的pHpH不同。電極緩沖液為不同。電極緩沖液為pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液，緩沖液，分離膠為分離膠為pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl緩沖液。緩沖液。3.3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。不連續(xù)系統(tǒng)，有三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠不連續(xù)系統(tǒng)，有三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。16三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺

13、凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGESDS-PAGE）簡稱簡稱SDSSDSPAGEPAGE。是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量的一種是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量的一種最好的辦法最好的辦法 。171.1.原理：原理：SDSSDS是種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷，是種陰離子去污劑，帶有大量負(fù)電荷

14、，與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。白質(zhì)間原有電荷的差異。SDS SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵，巰基乙醇使二硫鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物復(fù)合物形狀近似橢圓形，短軸相同形狀近似橢圓形，短軸相同（1.8nm1.8nm），），長軸與蛋白質(zhì)分長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。子量成正比。因此，蛋白質(zhì)因此，蛋白質(zhì)SDSSDS復(fù)合物在凝膠中的遷

15、移率不復(fù)合物在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒長度（蛋白質(zhì)分子量）（蛋白質(zhì)分子量）有關(guān)。有關(guān)。18未知蛋白質(zhì)在相同條件未知蛋白質(zhì)在相同條件未知蛋白質(zhì)在相同條件未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，可在標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行電泳，可在標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行電泳，可在標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行電泳，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。曲線上求得分子量。曲線上求得分子量。曲線上求得分子量。192.2.操作：操作：（SDS-PAGESDS-PAGE及及PAGEPAGE，即變性及非變性），即變性及非變性）1 1）制膠）制膠:（變性：（變性：buffer buffer 中加中加0.4%SDS0

16、.4%SDS）a.a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠濃度的分離膠（查表），（查表），配制分離膠溶液：配制分離膠溶液：Acr:Bis=29:1 Acr:Bis=29:1，分離膠，分離膠buffer,buffer,TEMED,AP,TEMED,AP,水水 迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h0.5h聚合完聚合完全。全。b.b.濃縮膠：用濃縮膠濃縮膠：用濃縮膠bufferbuffer。插上梳子。插上梳子。202 2）樣品制備：）樣品制備：a.PAGE:a.PAGE:樣品樣品緩沖液樣品樣品緩沖液（蔗糖或甘油指

17、示劑溴酚藍(lán)）（蔗糖或甘油指示劑溴酚藍(lán)）b.SDS-PAGE:b.SDS-PAGE:樣品樣品緩沖液樣品樣品緩沖液（SDSSDS，甘油，巰基乙醇，甘油，巰基乙醇，溴酚藍(lán)），溴酚藍(lán)），煮沸煮沸2-5min2-5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3 3）加樣及電泳：）加樣及電泳：SDS-PAGE:SDS-PAGE:電極電極bufferbuffer中加中加0.1%SDS0.1%SDS，溴酚藍(lán)，溴酚藍(lán)距下端距下端1cm1cm時停止電泳。時停止電泳。214 4）固定及染色）固定及染色a.a.固定：將凝膠浸于固定：將凝膠浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙酸中三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。固定蛋

18、白質(zhì)組分。b.b.染色：染色：考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)染色法 銀染法銀染法（靈敏度比前者高（靈敏度比前者高100100倍）倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍(lán)，過碘酸SchiffSchiff試劑（糖蛋白）。試劑（糖蛋白）。22四、等電聚焦電泳四、等電聚焦電泳(isoelectric focusingisoelectric focusingisoelectric focusingisoelectric focusing，IEF)IEF)IEF)IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性，以以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載

19、體聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)（商品名：（商品名：（商品名：（商品名：AmpholineAmpholineAmpholineAmpholine，一種含有各種連續(xù)一種含有各種連續(xù) pI pI 的小分的小分子混合物子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電等電聚焦電泳（泳（IEF-PAGEIEF-PAGE）。）。自學(xué)自學(xué)23第五節(jié)第五節(jié) 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶酶的濃縮、干燥與結(jié)晶一、酶的濃縮一、酶的濃縮 1 1 蒸發(fā)濃縮蒸發(fā)濃縮 圖圖 4-60 4-60 減壓蒸發(fā)濃縮的簡易裝置減壓蒸發(fā)濃縮的簡易裝置 1 1蒸餾瓶蒸餾瓶 2 2毛細(xì)管毛細(xì)管 3 3螺

20、旋夾螺旋夾 4 4橡皮管橡皮管 5 5溫度計溫度計 6 6出水口出水口 7 7冷凝器冷凝器 8 8進(jìn)水口進(jìn)水口 9 9連接管連接管 10 10抽氣口抽氣口 11 11接收瓶接收瓶242 2 超濾濃縮超濾濃縮 超濾濃縮以壓力超濾濃縮以壓力差為動力，將待濃差為動力，將待濃縮溶液通過超濾膜，縮溶液通過超濾膜，酶分子較大被滯留，酶分子較大被滯留，水分子和小分子選水分子和小分子選擇性透過，達(dá)到濃擇性透過，達(dá)到濃縮目的縮目的 。圖圖4-61 酶的超濾濃縮酶的超濾濃縮 25 3 3 吸水劑吸水劑 膠過濾濃縮膠過濾濃縮 利用葡聚糖凝膠利用葡聚糖凝膠Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-5

21、0G-50等的等的吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤吸水特性。將干膠直接加入樣品溶液，吸水膨潤后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。后，再過濾或離心分出濃縮的酶液。26聚乙二醇濃縮：聚乙二醇濃縮：聚乙二醇聚乙二醇（polyethylene glycolpolyethylene glycol），），簡稱簡稱PEG PEG。利用利用PEGPEG的吸水特性。將的吸水特性。將PEGPEG涂于裝有酶溶液涂于裝有酶溶液的透析袋上，置于的透析袋上，置于44下，干下，干PEGPEG粉末吸收水和鹽粉末吸收水和鹽類，酶溶液即被濃縮。類，酶溶液即被濃縮。一般用分子量大的一般用分子量大的PEG,PEG,如如PEG

22、6,000PEG 6,000和和PEG 20,000PEG 20,000，以防止，以防止PEGPEG進(jìn)進(jìn)入蛋白質(zhì)溶液。入蛋白質(zhì)溶液。274 4 反復(fù)凍融濃縮反復(fù)凍融濃縮 利用酶溶液相對于純水冰點(diǎn)較低的原利用酶溶液相對于純水冰點(diǎn)較低的原理使酶分子與小分子物質(zhì)分離。理使酶分子與小分子物質(zhì)分離。5 5 沉淀法沉淀法 鹽析法，有機(jī)溶劑法鹽析法，有機(jī)溶劑法28二、酶的干燥二、酶的干燥 酶的干燥多采用冷凍干燥法。酶的干燥多采用冷凍干燥法。將酶溶液在較低溫度下將酶溶液在較低溫度下（-10-10到到-50-50）凍結(jié)成固態(tài)，然后在高度真空條件下，將凍結(jié)成固態(tài)，然后在高度真空條件下，將其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)

23、而除去，也其中固態(tài)水分直接升華為氣態(tài)而除去，也稱酶的升華干燥。稱酶的升華干燥。三、酶的結(jié)晶三、酶的結(jié)晶 結(jié)晶結(jié)晶（Crystallization）是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)是指物質(zhì)以晶體的狀態(tài)從蒸汽或溶液中析出的過程。從蒸汽或溶液中析出的過程。29結(jié)晶的條件結(jié)晶的條件 1.1.酶的純度酶的純度:純度越高越易結(jié)晶（純度越高越易結(jié)晶（5050 ）2.2.酶的濃度酶的濃度 （恰到好處）（恰到好處）:濃度越高越易結(jié)晶，控制在飽和區(qū)以濃度越高越易結(jié)晶，控制在飽和區(qū)以上，過飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi)上，過飽和區(qū)以下的介穩(wěn)區(qū)內(nèi)。3.3.結(jié)晶溫度結(jié)晶溫度 4.4.溶液溶液pHpH5.5.離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度 6.6.晶核晶核

24、 7.7.結(jié)晶時間結(jié)晶時間30 第五節(jié)第五節(jié) 純化方案的設(shè)計與評價純化方案的設(shè)計與評價 一、純化方案的設(shè)計一、純化方案的設(shè)計 1 1 純化方法的選擇依據(jù)純化方法的選擇依據(jù) 根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異根據(jù)有效成分和雜質(zhì)之間理化性質(zhì)的差異 調(diào)節(jié)溶解度：調(diào)節(jié)溶解度：沉淀法沉淀法 根據(jù)分子大小、形狀的不同：根據(jù)分子大小、形狀的不同：離心分離，膜分離，凝膠過濾離心分離，膜分離，凝膠過濾 根據(jù)分子電荷性質(zhì)的不同：根據(jù)分子電荷性質(zhì)的不同：離子交換層析，電泳離子交換層析，電泳 根據(jù)專一性結(jié)合的方法：根據(jù)專一性結(jié)合的方法：親和層析親和層析 其它：其它：吸附層析，疏水層析吸附層析，疏水層析312 2 純

25、化方法的排序純化方法的排序 先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積的方法。精確、費(fèi)時、需樣品少的方法，積的方法。精確、費(fèi)時、需樣品少的方法，宜后選用。宜后選用。32二、純化方案的評價二、純化方案的評價1 1 酶活力測定：酶活力測定：酶活力酶活力(enzyme activity)(enzyme activity)又稱酶活性，即單位時又稱酶活性，即單位時間內(nèi)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物生成量間內(nèi)酶促反應(yīng)的產(chǎn)物生成量.是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。33 方法：方法：在酶反應(yīng)開始后不同時間，從反應(yīng)系在酶反應(yīng)開始后不同時間，從反應(yīng)系統(tǒng)中取出一定量反應(yīng)液，用適當(dāng)

26、方法停止統(tǒng)中取出一定量反應(yīng)液，用適當(dāng)方法停止其反應(yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在物化性質(zhì)其反應(yīng)后，再根據(jù)產(chǎn)物和底物在物化性質(zhì)上的差別進(jìn)行分析，求得單位時間的酶促上的差別進(jìn)行分析，求得單位時間的酶促反應(yīng)變化量。反應(yīng)變化量。34常用的方法常用的方法 ：化學(xué)分析法化學(xué)分析法（比色法）（比色法）：產(chǎn)物可與特定的化學(xué)：產(chǎn)物可與特定的化學(xué)試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的有色溶液試劑反應(yīng)生成穩(wěn)定的有色溶液 。分光光度法分光光度法:利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的利用底物和產(chǎn)物光吸收性質(zhì)的不同不同 。量氣法量氣法:酶促反應(yīng)中產(chǎn)物或底物之一為氣體。酶促反應(yīng)中產(chǎn)物或底物之一為氣體。滴定法滴定法（pHpH值測量法）值測量法）：產(chǎn)物之一是自由的

27、酸性：產(chǎn)物之一是自由的酸性物質(zhì)或堿性物質(zhì)。多用物質(zhì)或堿性物質(zhì)。多用pHpH電極測。電極測。35 常用終止反應(yīng)方法：常用終止反應(yīng)方法：改變反應(yīng)最適條件：改變反應(yīng)最適條件：加酸、堿、加熱加酸、堿、加熱 加酶變性劑：加酶變性劑：5 5三氯乙酸三氯乙酸 36 酶活力單位：酶活力單位：通常采用國際酶學(xué)委員會規(guī)定的通常采用國際酶學(xué)委員會規(guī)定的單位。單位。在純化過程中，為了方便，可采用自行規(guī)定的在純化過程中，為了方便，可采用自行規(guī)定的單位，只要達(dá)到可比較的目的即可，如直接以光密單位，只要達(dá)到可比較的目的即可，如直接以光密度值表示。度值表示。372 2 蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度測定 紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸

28、殘基中苯環(huán)有共紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸殘基中苯環(huán)有共軛雙鍵，在軛雙鍵，在A A280280有最大吸收。有最大吸收。特點(diǎn)：特點(diǎn)：簡便、快速、簡便、快速、不損耗樣品，但干擾因素多。不損耗樣品，但干擾因素多。雙縮脲法：具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物雙縮脲法：具有兩個或兩個以上肽鍵的化合物均有雙縮脲反應(yīng)。均有雙縮脲反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速快速.缺點(diǎn)：靈敏度差缺點(diǎn)：靈敏度差 酚試劑酚試劑（Folin-Folin-酚）酚）測定法：測定法：繁瑣，但靈敏度、準(zhǔn)確度高。繁瑣，但靈敏度、準(zhǔn)確度高。染料結(jié)合法染料結(jié)合法（考馬斯亮藍(lán)染色法）（考馬斯亮藍(lán)染色法）：又稱：又稱BradfordBradford法，法，靈敏、

29、簡便、快速、干擾少，是常用的檢測法。靈敏、簡便、快速、干擾少，是常用的檢測法。38 3 3 酶的純化指標(biāo)酶的純化指標(biāo) 純度純度 提純倍數(shù)提純倍數(shù) 回收率回收率 常用比活力表示酶的純度：常用比活力表示酶的純度：酶活力（酶活力（u/ml）比活力比活力 蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（mg蛋白蛋白/ml酶液）酶液）比活力越高，酶純度也越好。比活力越高，酶純度也越好。39 提提純倍數(shù)純倍數(shù)=提純后比活力提純后比活力/提純前比活力提純前比活力 提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好。提純倍數(shù)越大，表示該方法純化效果越好?；厥章驶厥章侍峒兒竺缚偦盍μ峒兒竺缚偦盍?提純前酶總活力提純前酶總活力100100 表示提純過

30、程中酶損失程度的大小。表示提純過程中酶損失程度的大小?；厥章试礁?，損失越小。回收率越高，損失越小。總活力酶活力單位數(shù)總活力酶活力單位數(shù) 酶液總體積酶液總體積 即樣品中全部酶活力。即樣品中全部酶活力。40 判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活判斷一個分離純化方法的優(yōu)劣，常用總活力的回收率和比活力的提純倍數(shù)力的回收率和比活力的提純倍數(shù)兩個指標(biāo)。兩個指標(biāo)?；厥章剩悍从趁傅膿p失情況?；厥章剩悍从趁傅膿p失情況。提純倍數(shù)：表示方法的有效程度。提純倍數(shù)：表示方法的有效程度。一個好的純化步驟是回收率較高，提純倍一個好的純化步驟是回收率較高，提純倍數(shù)也較大。數(shù)也較大。414 4 純化表純化表提純倍數(shù):0.6/0

31、.416=1.44 9.8/0.416=23.6 500/0.416=1200比活力:5/12=0.416 11/3=3.67 364/7=52總活力:51000=5000 17010=1700產(chǎn)率(回收率):4800/5000=96%1820/5000=36.4%1500/5000=30%酶濃度:5000/1000=5 1820/5=364 1700/10=17042思考題：思考題：1 PAGE 和和 SDSPAGE電泳的原理有何區(qū)別電泳的原理有何區(qū)別?應(yīng)應(yīng)用有何不同用有何不同?2酶活力酶活力 酶比活酶比活3酶的純化效率通常采用哪些指標(biāo)酶的純化效率通常采用哪些指標(biāo)?它們?nèi)绾斡嬎闼鼈內(nèi)绾斡嬎?43