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1、第二章:基因工程工具酶,主講教師: 楊應(yīng)斌答疑QQ號(hào): 715656164,基因工程,一、DNA限制性?xún)?nèi)切酶,二、甲基化酶,三、分子克隆過(guò)程中所需要的另一些酶,Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）發(fā)現(xiàn)了噬菌體的限制作用,各種細(xì)菌都能合成一種或幾種順序?qū)Ｒ坏暮怂醿?nèi)切酶。這些酶切割DNA的雙鏈，因?yàn)樗鼈兊墓δ芫褪乔懈頓NA，限制外源性DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，所以稱(chēng)這種核酸內(nèi)切酶為限制酶。,合成限制酶的細(xì)胞自身的DNA可以不受這種酶的作用，因?yàn)榧?xì)胞還合成了一種修飾酶，它改變了限制酶識(shí)別的DNA順序的結(jié)構(gòu)，使限制酶不能起作用。,目前，從各種生物中分離出的限制性

2、內(nèi)切酶已接近200種，其中80多種是切割DNA雙鏈。,（一）命名原則,限制性?xún)?nèi)切酶主要是從原核生物中提取的?，F(xiàn)在通用的命名原則是：,屬名,種名,株名,如果同一菌株中有幾種不同的內(nèi)切酶時(shí)，則分別用羅馬數(shù)字、來(lái)代表。,Haemophilus,influeuzae,d,酶名,Hind III,Escherichia,coli,RY13,EcoR,（二）分類(lèi)和特性,第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文順序, 如EcoRI的識(shí)別順序?yàn)椋?討論:下面的序列中可能含有多少個(gè)潛在的酶切位點(diǎn)?,GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA,1,3,2,6,5,4,一、DNA限制性?xún)?nèi)切酶,

3、二、甲基化酶,三、分子克隆過(guò)程中所需要的另一些酶,二、甲基化酶,限制-修飾系統(tǒng)中的修飾作用是由甲基化酶（methylase）來(lái)完成的。甲基化酶同限制性?xún)?nèi)切酶具有完全相同的識(shí)別順序。甲基化酶使識(shí)別順序中的某個(gè)堿基發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性?xún)?nèi)切酶切開(kāi)。,DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中，能將 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。,在原核生物中，DNA 甲基化酶作為限制修飾系統(tǒng)的一個(gè)組成部分廣泛存在，它們的作用是保護(hù)宿主菌不被相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切割。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌包括三種位點(diǎn)特異性的 DNA 甲基化酶。,由 dam 基因（Dam 甲基化酶）編碼的甲基化酶能

4、將甲基轉(zhuǎn)移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位點(diǎn)上。,由 dcm 基因編碼的 Dcm 甲基化酶，能在CCAGG 和 CCTGG 序列內(nèi)部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。,EcoKI 甲基化酶，可將 AAC（N6A）GTGC 和 GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤進(jìn)行甲基化修飾。,(1) 原核生物甲基化,如果限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)是從表達(dá) Dam或 Dcm 甲基化酶的菌株中分離而得，并且其甲基化識(shí)別位點(diǎn)與內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有重疊，那么該限制性?xún)?nèi)切酶的部分或全部酶切位點(diǎn)有可能不被切割。,例如，從 dam+ E.coli 中分離的質(zhì)粒 DNA 完全不能被識(shí)別序列為 GATC 的 MboI 所切割。,E.

5、coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全修飾（因此完全不能被 MboI 切割），而 DNA 只有大約 50% 的 Dam 位點(diǎn)被甲基化，這是因?yàn)樵?DNA 被包裝到噬菌體頭部之前，甲基化酶還沒(méi)來(lái)得及將 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻斷的酶卻能對(duì)這些 DNA 進(jìn)行部分切割。,被 Dam 或 Dcm 甲基化的限制性位點(diǎn)可以通過(guò)克隆 DNA 至 dam- /dcm- 菌株【如 dam- /dcm- E.coli 感受態(tài)細(xì)胞（NEB #C2925）】進(jìn)行去甲基化。,(1) 真核生物甲基化,在高等真核生物（如 Dnmt1）中發(fā)現(xiàn)的

6、 CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶（CpG MTases），將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移至胞嘧啶殘基上的 C5 位點(diǎn)。,CpG 甲基化形式受遺傳因素的影響，具有組織特異性，并與基因表達(dá)相關(guān)。因此，我們推測(cè) CpG 甲基化在基因分化和表達(dá)中起了一定的作用。,在消化真核基因組 DNA 時(shí)尤其要關(guān)注 CpG甲基化的影響。需要注意的是，一旦 DNA 被克隆到宿主菌中，將不存在 CpG 甲基化形式。,一、DNA限制性?xún)?nèi)切酶,二、甲基化酶,三、分子克隆過(guò)程中所需要的另一些酶,（一）DNA聚合酶,（二）RNA聚合酶,（三）反轉(zhuǎn)錄酶,（四）核酸外切酶,（五）核酸酶S1,（六）DNA酶,（七）RNA酶,（八）連接酶,（九）末端轉(zhuǎn)移酶,（十

7、）堿性磷酸酶,（一）DNA聚合酶,（DNa polymerase）的作用是將1個(gè)脫氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3-OH上，釋放出一個(gè)焦磷酸分子（ppi),聚合酶主要有以下兩種種：,1大腸桿菌DNA聚合酶,2噬菌體DNA聚合酶,1大腸桿菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3種作用：,53的聚合作用。但不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ)DNA，填補(bǔ)DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。,35的外切酶活性。消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核苷酸。,53外切酶活性。切除受損傷的DNA。,大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段是完整的DNA聚合酶的一個(gè)片段，只有在53聚合

8、酶活性和35外切酶活性，失去了53外切酶活性。,2噬菌體DNA聚合酶,這里以T4DNA聚合酶為例。它也具有53聚合酶活性，但它的外切酶活性比大腸桿菌的要高200倍。因此，它也可用來(lái)補(bǔ)齊單鏈末端或標(biāo)記同位素。,催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶是一種由多個(gè)蛋白亞基組成的復(fù)合酶。,（二）RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶,真核生物的RNA聚合酶分三類(lèi)：,RNA聚合酶存在于核仁中，轉(zhuǎn)錄rRNA順序。,RNA聚合酶存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄大多數(shù)基因，需要“TATA”框。,RNA聚合酶存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄很少幾種基因如tRNA基因如5SrRNA基因。,（三）反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄酶（Reverse transcripatase）是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶。,（四）核酸外切酶,大腸桿菌核酸外切酶（exonuclease ）是從帶3-OH末端的雙鏈DNA，按35方向切除5單核苷酸：,（八）連接酶,（十）堿性磷酸酶,本章結(jié)束!,演講完畢，謝謝觀(guān)看！,