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1、高效液相色譜法高效液相色譜法12一、一、概述概述高效液相色譜法與經典液相色譜法高效液相色譜法與經典液相色譜法經典液相柱經典液相柱色譜裝置色譜裝置高效液相色譜儀高效液相色譜儀經典液相色譜經典液相色譜HPLC固定相粒徑固定相粒徑流動相驅動方式流動相驅動方式流動相流速流動相流速150-200 m重力或低壓泵重力或低壓泵很慢很慢3-10 m高壓泵高壓泵快快(1-10mL/min)例：分離例：分離20種氨基酸種氨基酸柱長：柱長：170 cm柱徑：柱徑：0.9 cmF：30 mL/ht分離分離:20 h經典柱色經典柱色譜譜HPLCt分離分離：1 h3二、二、基本理論基本理論1 1、色譜柱柱效的基本關系式、

2、色譜柱柱效的基本關系式2 2、分離度、分離度43 3、速率方程速率方程溶質在液相流動相溶質在液相流動相中的擴散系數(shù)，約中的擴散系數(shù)，約為氣相中擴散系數(shù)為氣相中擴散系數(shù)的萬分之一的萬分之一5流動相流速對板高的影響流動相流速對板高的影響1)小顆粒填料，填充均勻；小顆粒填料，填充均勻；2)選擇較低的流動相流速；選擇較低的流動相流速；3)選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質。選擇粘度小的溶劑作流動相，改善傳質。修正的速率方程：修正的速率方程：提高柱效提高柱效途徑途徑6三、三、高效液相色譜分離方法高效液相色譜分離方法1 1、吸附色譜法、吸附色譜法 分離原理分離原理Kad值越大，保留時間越長。值越大，保留時

3、間越長。7固定相固定相硅膠強極性硅膠強極性氧化鋁弱極性氧化鋁弱極性活性炭非極性活性炭非極性分子篩分子篩強極性強極性高分子多孔微球高分子多孔微球(GDX)固體吸附劑固體吸附劑82 2、離子交換色譜法離子交換色譜法陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂陽離子交換陽離子交換陰離子交換陰離子交換分離原理分離原理9 固定相固定相陽離子陽離子：SO3H(強強)CO2H(弱弱)陰離子：陰離子：N+R3(強強)NH2(弱弱)基基質質合成樹脂合成樹脂纖維素纖維素硅膠硅膠離子交換劑離子交換劑10 流動相流動相水相水相緩沖液緩沖液+有機改性劑有機改性劑調節(jié)選擇性的調節(jié)選擇性的主要參數(shù)主要參數(shù)鹽種類及濃度鹽種類及濃度pH值值各

4、種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：各種陰離子的在陰離子交換劑上的滯留次序：用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快用檸檬酸離子洗脫比用氟離子洗脫快11 應用：應用：離子及可離解的化合物離子及可離解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白質等如氨基酸、核酸、蛋白質等123、化學鍵合相色譜化學鍵合相色譜采用化學鍵合相采用化學鍵合相的液相色譜的液相色譜固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失。由于可將各種極性的官能團鍵合到載體表面，因可將各種極性的官能團鍵合到載體表面，因此它適用于種類繁多樣品的分離。此它適用于種類繁多樣品的分離。特點特點13鍵合固定相制備鍵合固定相制備ODS(C18)

5、鍵合相鍵合相硅膠硅膠十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非極性非極性硅烷化反應硅烷化反應使用使用pH范圍：范圍：2-814鍵合固定相類鍵合固定相類型型疏水基團疏水基團烷烴（烷烴（C8和和C18）、苯基等）、苯基等極性基團極性基團丙氨基丙氨基氰乙基氰乙基醚和醇等醚和醇等離子交換基團離子交換基團胺基、季銨鹽胺基、季銨鹽磺酸、羧酸磺酸、羧酸15鍵合相色譜法分類鍵合相色譜法分類反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜:常用固定相：常用固定相：C18分離對象分離對象:非極性非極性中等極性化合物中等極性化合物常用流動相常用流動相甲醇甲醇-水水乙睛乙睛-水水反相鍵合相色譜反相鍵合相色譜疏溶劑分離機制疏溶劑分離機制固定相極性固定

6、相極性 流動相極性流動相極性離子性鍵合相色譜離子性鍵合相色譜將各種離子交換基團化學鍵合到硅膠基質將各種離子交換基團化學鍵合到硅膠基質表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固表面上，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相。其分離原理與離子交換色譜類同。定相。其分離原理與離子交換色譜類同。17例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇例：甲苯和苯酚的分離。流動相：甲醇-水水出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：苯酚，甲苯出峰順序：甲苯，苯酚出峰順序：甲苯，苯酚十八烷基十八烷基鍵合相鍵合相二醇基二醇基鍵合相鍵合相18保留時間：保留時間：例：以例：以ODS鍵合色譜柱、甲醇鍵合色譜柱、甲醇-水為流動相分離以水為流動相分離以下兩種

7、苯甲酸，試判斷出峰次序。下兩種苯甲酸，試判斷出峰次序。沒食子酸沒食子酸3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸固定相固定相:非極性非極性;流動相流動相:極性極性組分極性組分極性:3,4-二羥基苯甲酸二羥基苯甲酸沒食子酸沒食子酸194 4、尺寸排阻尺寸排阻(凝膠凝膠)色譜法色譜法排阻色譜分離示意圖排阻色譜分離示意圖相對分子質量差別相對分子質量差別大于大于10的化合物的化合物才可以分離才可以分離分離原理分離原理20四、四、高效液相色譜儀高效液相色譜儀21高壓泵高壓泵流動相流動相溶劑溶劑廢液廢液色譜柱色譜柱進樣口進樣口檢測器檢測器221 1、高壓輸液系統(tǒng)高壓輸液系統(tǒng)高壓泵高壓泵要求要求輸出壓力高輸出壓力高平

8、穩(wěn)、脈沖小平穩(wěn)、脈沖小流量穩(wěn)定可調流量穩(wěn)定可調耐腐蝕耐腐蝕23梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置 低壓梯度低壓梯度 高壓梯度高壓梯度 通過改變流動相的組成來調整組通過改變流動相的組成來調整組分的分的k k值，改變分離因子值，改變分離因子值，值，以達到最短時間內得到最佳分離以達到最短時間內得到最佳分離的目的。的目的。梯度洗脫梯度洗脫24等度洗脫與梯度洗脫等度洗脫與梯度洗脫25貯液瓶及流動相貯液瓶及流動相1)對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產生沉淀。對樣品有一定的溶解度，以防在柱頭產生沉淀。2)適用于所選擇的檢測器。適用于所選擇的檢測器。3)化學惰性好，以免破壞固定相?；瘜W惰性好，以免破壞固定相。4)低粘度

9、，增加樣品的擴散系數(shù)，提高柱效。低粘度，增加樣品的擴散系數(shù)，提高柱效。5)純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產生偽峰。純度高。溶劑不純會增加檢測器噪聲，產生偽峰。對流動相溶劑對流動相溶劑的一般要求的一般要求262、進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng) 準備狀態(tài)準備狀態(tài) 進樣狀態(tài)進樣狀態(tài)六通閥進樣六通閥進樣 裝置裝置自動進樣器自動進樣器 273、色譜柱色譜柱內徑：內徑：16 mm，柱長：柱長：530 cm；柱填料粒徑：柱填料粒徑：15 m 分離柱分離柱284、檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)紫外吸收檢測器紫外吸收檢測器(a)可變波長紫外檢測器可變波長紫外檢測器(b)二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器氘燈氘燈光柵光柵流流通通池池測測量

10、量光光電電二二極極管管參比光電二極管參比光電二極管二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器29兩種檢測器的色譜圖兩種檢測器的色譜圖(a)：可變波長紫外檢測器；可變波長紫外檢測器；(b)：二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器(b)(a)30紫外檢測器紫外檢測器靈敏度高，靈敏度高，精密度及線性范圍較好精密度及線性范圍較好 ，可用于梯度洗脫。，可用于梯度洗脫。流動相選擇有限制。流動相選擇有限制。一些常用溶劑的紫外截止波長一些常用溶劑的紫外截止波長溶劑溶劑CS2氯仿氯仿四氫四氫呋喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截止波長紫外截止波長（nm）38024521221019020518731熒光檢測器熒光檢測器靈敏度高，選擇靈敏度高，選擇性好，可用于梯度性好，可用于梯度洗脫。洗脫。32示差折光檢測器示差折光檢測器利用組分與流動利用組分與流動相的折射率之差進相的折射率之差進行檢測。行檢測。通用性好，靈敏通用性好，靈敏度較低，度較低，不適用于不適用于梯度洗脫。梯度洗脫。33化學發(fā)光檢測器化學發(fā)光檢測器