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1、 動(dòng)物寄生蟲(chóng)病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）技術(shù)是一種既敏感又特異的DNA體外擴(kuò)增方法，它可將一小段目的DNA擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，其擴(kuò)增效率使得該方法可檢測(cè)到單個(gè)蟲(chóng)體或僅部分蟲(chóng)體的微量DNA。通過(guò)設(shè)計(jì)種、株特異的引物，此法只擴(kuò)增出種、株特異的PCR產(chǎn)物，具有很高的特異性。而且PCR技術(shù)的操作過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需對(duì)病原進(jìn)行分離純化；同時(shí)可以克服抗原和抗體持續(xù)存在的干擾，直接檢測(cè)到病原體的DNA，既可用于蟲(chóng)種、株的鑒別，動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的臨床診斷，又可用于動(dòng)物寄生蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著PCR技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)

2、、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊笳莆誔CR診斷技術(shù)所涉及實(shí)驗(yàn)的基本原理，全面熟悉PCR診斷技術(shù)的操作過(guò)程，其中包括寄生蟲(chóng)DNA的提取、PCR引物的設(shè)計(jì)、PCR條件的優(yōu)化、對(duì)目的片斷的擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及結(jié)果分析、PCR產(chǎn)物的純化等等。二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料（一）寄生蟲(chóng)基因組DNA的提取及純化1.蟲(chóng)體材料。 單個(gè)蟲(chóng)體。2.器具。 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。3.試劑。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminete

3、tra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化鈉、蛋白酶K（25g/l）、異丙醇（80%）、雙蒸水、滅菌超純水等。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 l 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 l、50 mM EDTA（pH 8.0）150 l、10%SDS 30 l。(3) WizardTM DNA Clean-Up 試劑盒或類(lèi)似的DNA提取試劑盒。（二）PCR擴(kuò)增及瓊

4、脂糖電泳1材料。 提純的蟲(chóng)體DNA。2器具。 超凈工作臺(tái)、微型高速臺(tái)式離心機(jī)、微量取液器（2/20/200/1000 l）、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、4/-20冰箱、紫外透射儀、微型離心管（200/500/1500 l）、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。3試劑。(1) 10PCR Buffer（無(wú)Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、瓊脂糖、EB（10mg/ml）、Tris堿、硼酸（Boric acid）、去離子水、EDTA（

5、0.5 mol/L，pH 8.0）、10載樣緩沖液。(2) 0.5TBE緩沖液：準(zhǔn)確秤取Tris堿5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去離子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去離子水定容至1000ml。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化1材料。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2器具。 TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；三用電熱恒溫水箱；微量取液器（2/20/200/1000 l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4/-20冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 l）、有機(jī)架、透明膠帶、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手術(shù)刀、保鮮紙等。3試劑。

6、瓊脂糖；0.5TBE緩沖液；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒；UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇（80%）等。三、實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)(一) 寄生蟲(chóng)基因組DNA的提取及純化1.實(shí)驗(yàn)原理。 應(yīng)根據(jù)研究目的來(lái)決定是從單個(gè)蟲(chóng)體還是多個(gè)蟲(chóng)體提取基因組DNA。寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體的各個(gè)部位都可以作為基因組DNA的抽提材料，如果蟲(chóng)體較大的話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗(yàn)證其種類(lèi)。如果蟲(chóng)體較?。ㄐ∮? cm），則應(yīng)使用整條蟲(chóng)體抽取DNA。若蟲(chóng)體特別細(xì)小（例如幼蟲(chóng)），可用多條蟲(chóng)體來(lái)提取DNA。為了獲得高含量、高純度的DNA，最好使用新鮮材料。從凍干或50%-70%乙醇保存的寄生蟲(chóng)材

7、料中也可較容易地提取DNA。寄生蟲(chóng)DNA的抽提方法有多種，不同種類(lèi)的寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體都有其最適合的抽提方法，但各種方法的基本原理都一樣，即先用機(jī)械的方法將蟲(chóng)體組織破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，蟲(chóng)體組織中的細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，將蟲(chóng)體基因組DNA釋放到溶液中。在裂解過(guò)程中，蟲(chóng)體細(xì)胞碎片及大部分蛋白質(zhì)會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中的SDS包蓋，通過(guò)離心沉淀，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來(lái)，變性劑也同時(shí)被除去，從而就可從上清中回收蟲(chóng)體基因組DNA溶液?；厥蘸蟮南x(chóng)體基因組DNA液用WizardTM DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。純化時(shí)，DNA溶液與純化試劑盒中的清洗樹(shù)脂混合后，

8、其混合液在通過(guò)微型柱時(shí)DNA會(huì)結(jié)合在柱上，而其它雜質(zhì)會(huì)通過(guò)微型柱排出；再用80%異丙醇進(jìn)行沖洗，去除殘余雜質(zhì)。最后，在微型柱中加入預(yù)熱的TE緩沖液或超純水，使結(jié)合在微型柱上的DNA充分溶解，通過(guò)離心，其洗脫液即為純化的蟲(chóng)體基因組DNA溶液。2實(shí)驗(yàn)方法、步驟和操作要領(lǐng)。(1) 蟲(chóng)體材料的處理(若為新鮮或凍干保存的蟲(chóng)體，則不需要此步驟)。若蟲(chóng)體較大，用鑷子將保存在70%的酒精溶液中的蟲(chóng)體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端部分。用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2次后，再用超純水反復(fù)沖洗23次，置于一新的1.5ml的離心管中。若蟲(chóng)體較小，取一整條蟲(chóng)體經(jīng)如上洗滌處理。對(duì)于雞球蟲(chóng)，將保存在2.5%重鉻酸鉀溶液的卵

9、囊懸液以2000g離心10min，棄重鉻酸鉀溶液。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉處理卵囊20min，2000g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積的滅菌雙蒸水，3000g離心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗滌一次。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，然后將其輕輕地加在0.6M無(wú)菌蔗糖溶液之上，2000g離心5min，取上層卵囊加5倍體積的水，3000g離心10min，沉淀再用無(wú)菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2) 蟲(chóng)體材料的裂解。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過(guò)的微型眼科剪刀將蟲(chóng)體組織剪碎，加

10、入280l的SDS裂解緩沖液，輕輕混勻，再加入20l（25g/l）的蛋白酶K溶液。對(duì)于原蟲(chóng)如雞球蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)，將純化好的卵囊3000rpm/min 離心10min，去掉大部分上清后加入與卵囊體積相同的玻璃珠，漩渦震蕩直到有95卵囊破壁后，即可加入SDS裂解緩沖液及蛋白酶K溶液?；靹蚝螅庞诤銣嘏囵B(yǎng)箱中，37作用1248 h，其間不時(shí)搖動(dòng)離心管，使蟲(chóng)體組織裂解充分。(3) 蟲(chóng)體DNA的抽提和純化。首先進(jìn)行蟲(chóng)體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA Clean-Up System使用說(shuō)明對(duì)DNA進(jìn)行純化。方法如下： 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時(shí)的離心管，旋渦震蕩器

11、震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲(chóng)體DNA溶液。將上清轉(zhuǎn)移至一新的離心管中，加入1ml清洗樹(shù)脂（按50500l懸液/1 ml清洗樹(shù)脂的比例），旋渦震蕩混勻。 取一支5ml的一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。 將DNA-樹(shù)脂混合液全部轉(zhuǎn)移到注射器中，用注射器內(nèi)芯推液筒，慢慢地將DNA-樹(shù)脂混合液推過(guò)微型柱，排出廢液。 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%的異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過(guò)微型柱，以洗滌DNA-樹(shù)脂樣品。 拔去注射器，將微型柱套在潔凈的1.5

12、ml離心管上，10000rpm離心20sec，以除去殘留的異丙醇。 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新的離心管上，在柱中央加入3050l預(yù)熱（6070）的超純水或1TE緩沖液，靜置1 min，10000rpm離心20sec。離心管內(nèi)的液體即為DNA溶液。可將DNA溶液轉(zhuǎn)移至0.5 ml離心管中于-20冰箱保存?zhèn)溆?。（二）寄生蟲(chóng)DNA的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1.實(shí)驗(yàn)原理。(1) PCR引物設(shè)計(jì)。 PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核甘酸引物的正確設(shè)計(jì)。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的寡核甘酸片段，使其能有效地與目的片段兩端的序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵循以下原則： 長(zhǎng)度不能太長(zhǎng)，也不能太短，一般在

13、1825個(gè)堿基左右； G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%60%為宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈的解鏈溫度。PCR引物應(yīng)保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20個(gè)堿基的引物其Tm值約界于5662，這可為有效退火提供足夠的溫度。由于G+C間的氫鍵數(shù)較A+T間多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。對(duì)于短于20個(gè)堿基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物，Tm值的計(jì)算較為復(fù)雜。由于PCR擴(kuò)增的特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板的結(jié)合，因此，反應(yīng)中退火溫度應(yīng)根據(jù)兩個(gè)Tm值折衷選擇。 堿基的組成盡量隨機(jī)

14、，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3 末端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C； 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物本身復(fù)性。這樣二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基達(dá)3個(gè)以上，就容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 兩個(gè)引物之間不能互補(bǔ)，尤其應(yīng)避免3 末端的互補(bǔ)重疊以防止形成引物二聚體。兩個(gè)引物不應(yīng)有4個(gè)以上的堿基連續(xù)相同或互補(bǔ)； 引物的3 末端應(yīng)與目的片段完全相配。這對(duì)于獲得好的擴(kuò)增結(jié)果非常重要。如果能確定一個(gè)保守氨基酸，可將其密碼子的前2個(gè)堿基作為3 末端。 引物的5末端可不與目的片段互補(bǔ)，可被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物的5末端修飾包括：加酶切位點(diǎn)

15、，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點(diǎn)、引入翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子序列等。所附加的限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)是不會(huì)在引物以外的DNA上切割的。為了有效地切割限制性酶切位點(diǎn)，在限制性酶識(shí)別序列的5端常需添加2-3個(gè)非特異的額外堿基。 若是設(shè)計(jì)種或株特異性引物，引物與非特異序列的相似性不能超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)以上的互補(bǔ)堿基相同。可用DNAstar、MegAlign軟件比較相似性，用Oligo50來(lái)設(shè)計(jì)引物。(2) PCR的基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、適當(dāng)緩沖液（Mg2+）的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的DN

16、A片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過(guò)模板DNA、引物之間的變性，退火（復(fù)性），延伸三步反應(yīng)為一周期（cycle），循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA片段得以擴(kuò)增。由于每一周期所產(chǎn)生的DNA片段均能成為下一次循環(huán)的模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍。在實(shí)際應(yīng)用中，一般多用3035個(gè)循環(huán)。(3)瓊脂糖電泳的基本原理。 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，于沸水中溶解，45開(kāi)始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)的作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不