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1、 動(dòng)物寄生蟲病PCR診斷技術(shù) 聚合酶鏈反映（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)是一種既敏感又特異DNA體外擴(kuò)增辦法，它可將一小段目DNA擴(kuò)增上百萬(wàn)倍，其擴(kuò)增效率使得該辦法可檢測(cè)到單個(gè)蟲體或僅某些蟲體微量DNA。通過(guò)設(shè)計(jì)種、株特異引物，此法只擴(kuò)增出種、株特異PCR產(chǎn)物，具備很高特異性。并且PCR技術(shù)操作過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需對(duì)病原進(jìn)行分離純化；同步可以克服抗原和抗體持續(xù)存在干擾，直接檢測(cè)到病原體DNA，既可用于蟲種、株鑒別，動(dòng)物寄生蟲病臨床診斷，又可用于動(dòng)物寄生蟲病分子流行病學(xué)調(diào)查。隨著PCR技術(shù)不斷完善與發(fā)展，它已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物技術(shù)、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)

2、域，具備廣泛應(yīng)用前景。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)恳?guī)定掌握PCR診斷技術(shù)所涉及實(shí)驗(yàn)基本原理，全面熟悉PCR診斷技術(shù)操作過(guò)程，其中涉及寄生蟲DNA提取、PCR引物設(shè)計(jì)、PCR條件優(yōu)化、對(duì)目片斷擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及成果分析、PCR產(chǎn)物純化等等。二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料（一）寄生蟲基因組DNA提取及純化1.蟲體材料。 單個(gè)蟲體。2.器具。 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量取液器及配套吸頭、微量離心管、一次性注射器、微型眼科鑷、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有機(jī)架等。3.試劑。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷

3、基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷-鹽酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化鈉、蛋白酶K（25g/l）、異丙醇（80%）、雙蒸水、滅菌超純水等。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 l 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 l、50 mM EDTA（pH 8.0）150 l、10%SDS 30 l。(3) WizardTM DNA Clean-Up 試劑盒或類似DNA提取試劑盒。（二）PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1材料。 提純蟲體DNA。2器具。 超凈工作

4、臺(tái)、微型高速臺(tái)式離心機(jī)、微量取液器（2/20/200/1000 l）、PCR擴(kuò)增儀、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐、4/-20冰箱、紫外透射儀、微型離心管（200/500/1500 l）、有機(jī)架、一次性手套、透明膠帶、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。3試劑。(1) 10PCR Buffer（無(wú)Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、瓊脂糖、EB（10mg/ml）、Tris堿、硼酸（Boric acid）、去離子水、EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）、10載樣緩沖液。(

5、2) 0.5TBE緩沖液：精確秤取Tris堿5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去離子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去離子水定容至1000ml。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化1材料。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2器具。 TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)；三用電熱恒溫水箱；微量取液器（2/20/200/1000 l）、瓊脂糖電泳系統(tǒng)、微波爐、電子天平、4/-20冰箱、紫外透射儀、微型離心管（500/1500 l）、有機(jī)架、透明膠帶、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手術(shù)刀、保鮮紙等。3試劑。 瓊脂糖；0.5TBE緩沖液；UNIQ-10柱式DNA膠回

6、收試劑盒；UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒；異丙醇（80%）等。三、實(shí)驗(yàn)辦法、環(huán)節(jié)和操作要領(lǐng)(一) 寄生蟲基因組DNA提取及純化1.實(shí)驗(yàn)原理。 應(yīng)依照研究目來(lái)決定是從單個(gè)蟲體還是各種蟲體提取基因組DNA。寄生蟲蟲體各個(gè)部位都可以作為基因組DNA抽提材料，如果蟲體較大話可取其中部而保存其頭部及尾部，以備形態(tài)學(xué)鑒定以驗(yàn)證其種類。如果蟲體較?。ú淮笥? cm），則應(yīng)使用整條蟲體抽取DNA。若蟲體特別細(xì)?。ɡ缬紫x），可用多條蟲體來(lái)提取DNA。為了獲得高含量、高純度DNA，最佳使用新鮮材料。從凍干或50%-70%乙醇保存寄生蟲材料中也可較容易地提取DNA。寄生蟲DNA抽提辦法有各種，不同種類寄生

7、蟲蟲體均有其最適合抽提辦法，但各種辦法基本原理都同樣，即先用機(jī)械辦法將蟲體組織破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，蟲體組織中細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，將蟲體基因組DNA釋放到溶液中。在裂解過(guò)程中，蟲體細(xì)胞碎片及大某些蛋白質(zhì)會(huì)互相纏繞成大型復(fù)合物，后者被DNA裂解液中SDS包蓋，通過(guò)離心沉淀，這些復(fù)合物會(huì)從溶液中沉淀下來(lái)，變性劑也同步被除去，從而就可從上清中回收蟲體基因組DNA溶液?；厥蘸笙x體基因組DNA液用WizardTM DNA純化試劑盒進(jìn)行純化。純化時(shí)，DNA溶液與純化試劑盒中清洗樹脂混合后，其混合液在通過(guò)微型柱時(shí)DNA會(huì)結(jié)合在柱上，而其他雜質(zhì)會(huì)通過(guò)微型柱排出；再用80%異丙醇

8、進(jìn)行沖洗，去除殘存雜質(zhì)。最后，在微型柱中加入預(yù)熱TE緩沖液或超純水，使結(jié)合在微型柱上DNA充分溶解，通過(guò)離心，其洗脫液即為純化蟲體基因組DNA溶液。2實(shí)驗(yàn)辦法、環(huán)節(jié)和操作要領(lǐng)。(1) 蟲體材料解決(若為新鮮或凍干保存蟲體，則不需要此環(huán)節(jié))。若蟲體較大，用鑷子將保存在70%酒精溶液中蟲體材料取出，剪取其中部，保存其頭端或尾端某些。用雙蒸水重復(fù)吹打沖洗2次后，再用超純水重復(fù)沖洗23次，置于一新1.5ml離心管中。若蟲體較小，取一整條蟲體經(jīng)如上洗滌解決。對(duì)于雞球蟲，將保存在2.5%重鉻酸鉀溶液卵囊懸液以g離心10min，棄重鉻酸鉀溶液。以雙蒸水重懸，同法離心洗滌三次后，用20%次氯酸鈉解決卵囊20m

9、in，g離心沉淀卵囊，用適量飽和鹽水重懸卵囊沉淀，1500g離心10min，上清液加入4倍體積滅菌雙蒸水，3000g離心10min。卵囊沉淀再用上述辦法重新漂浮、洗滌一次。用少量滅菌雙蒸水重懸卵囊沉淀，然后將其輕輕地加在0.6M無(wú)菌蔗糖溶液之上，g離心5min，取上層卵囊加5倍體積水，3000g離心10min，沉淀再用無(wú)菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得純凈卵囊，可及時(shí)用于裂解以提取DNA。(2) 蟲體材料裂解。用滅菌且經(jīng)紫外燈照射過(guò)微型眼科剪刀將蟲體組織剪碎，加入280lSDS裂解緩沖液，輕輕混勻，再加入20l（25g/l）蛋白酶K溶液。對(duì)于原蟲如雞球蟲、隱孢子蟲，將純化好卵囊3000rpm/min

10、 離心10min，去掉大某些上清后加入與卵囊體積相似玻璃珠，漩渦震蕩直到有95卵囊破壁后，即可加入SDS裂解緩沖液及蛋白酶K溶液?；靹蚝螅庞诤銣嘏囵B(yǎng)箱中，37作用1248 h，其間不時(shí)搖動(dòng)離心管，使蟲體組織裂解充分。(3) 蟲體DNA抽提和純化。一方面進(jìn)行蟲體DNA提取，然后按Promega公司試劑盒WizardTM DNA Clean-Up System使用闡明對(duì)DNA進(jìn)行純化。辦法如下： 取出于恒溫培養(yǎng)箱中作用了約20小時(shí)離心管，旋渦震蕩器震蕩混勻，10000rpm離心2min，上清即為蟲體DNA溶液。將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中，加入1ml清洗樹脂（按50500l懸液/1 ml清洗樹脂比例

11、），旋渦震蕩混勻。 取一支5ml一次性注射器，去針頭，拔出注射器內(nèi)芯推液筒，接上WizardTM微型柱。 將DNA-樹脂混合液所有轉(zhuǎn)移到注射器中，用注射器內(nèi)芯推液筒，慢慢地將DNA-樹脂混合液推過(guò)微型柱，排出廢液。 將注射器從微型柱上拔出后，拿去注射器內(nèi)芯推液筒，再將注射器套在微型柱上，向注射器內(nèi)加入2 ml 柱洗溶液（80%異丙醇），用注射器內(nèi)芯推液筒慢慢將洗柱液通過(guò)微型柱，以洗滌DNA-樹脂樣品。 拔去注射器，將微型柱套在干凈1.5ml離心管上，10000rpm離心20sec，以除去殘留異丙醇。 將微型柱從注射器上轉(zhuǎn)移到一新離心管上，在柱中央加入3050l預(yù)熱（6070）超純水或1TE緩沖

12、液，靜置1 min，10000rpm離心20sec。離心管內(nèi)液體即為DNA溶液。可將DNA溶液轉(zhuǎn)移至0.5 ml離心管中于-20冰箱保存?zhèn)溆?。（二）寄生蟲DNAPCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1.實(shí)驗(yàn)原理。(1) PCR引物設(shè)計(jì)。 PCR反映成功擴(kuò)增一種核心條件在于寡核甘酸引物對(duì)的設(shè)計(jì)。PCR引物設(shè)計(jì)目是找到一對(duì)適當(dāng)寡核甘酸片段，使其能有效地與目片段兩端序列互補(bǔ)。設(shè)計(jì)引物時(shí)要遵循如下原則： 長(zhǎng)度不能太長(zhǎng)，也不能太短，普通在1825個(gè)堿基左右； G+C含量及Tm值：引物G+C含量以40%60%為宜。引物Tm值是指寡核苷酸解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下50%寡核苷酸雙鏈解鏈溫度。PCR引物應(yīng)保持合理G+C含

13、量。具有50%G+C20個(gè)堿基引物其Tm值約界于5662，這可為有效退火提供足夠溫度。由于G+C間氫鍵數(shù)較A+T間多，因而，G+C含量高DNA片段其Tm值也高。對(duì)于短于20個(gè)堿基引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)引物，Tm值計(jì)算較為復(fù)雜。由于PCR擴(kuò)增特異性取決于兩條引物與相應(yīng)模板結(jié)合，因而，反映中退火溫度應(yīng)依照兩個(gè)Tm值折衷選取。 堿基構(gòu)成盡量隨機(jī)，盡量不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在；特別是3 末端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)持續(xù)G或C； 引物內(nèi)部不應(yīng)有互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊形成發(fā)夾構(gòu)造或引物自身復(fù)性。這樣二級(jí)構(gòu)造會(huì)因空間位阻而影響引物與模板復(fù)性結(jié)合。若引物自身持續(xù)互補(bǔ)堿基達(dá)

14、3個(gè)以上，就容易形成發(fā)夾構(gòu)造。 兩個(gè)引物之間不能互補(bǔ)，特別應(yīng)避免3 末端互補(bǔ)重疊以防止形成引物二聚體。兩個(gè)引物不應(yīng)有4個(gè)以上堿基持續(xù)相似或互補(bǔ)； 引物3 末端應(yīng)與目片段完全相配。這對(duì)于獲得好擴(kuò)增成果非常重要。如果能擬定一種保守氨基酸，可將其密碼子前2個(gè)堿基作為3 末端。 引物5末端可不與目片段互補(bǔ)，可被修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5末端修飾涉及：加酶切位點(diǎn)，標(biāo)記生物素、熒光、同位素、地高辛等。還可引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列、引入突變位點(diǎn)、引入翻譯起始密碼子、啟動(dòng)子序列等。所附加限制性酶切位點(diǎn)應(yīng)是不會(huì)在引物以外DNA上切割。為了有效地切割限制性酶切位點(diǎn)，在限制性酶辨認(rèn)序列5端常需添加2-3個(gè)非特異

15、額外堿基。 若是設(shè)計(jì)種或株特異性引物，引物與非特異序列相似性不能超過(guò)70%或有持續(xù)8個(gè)以上互補(bǔ)堿基相似?？捎肈NAstar、MegAlign軟件比較相似性，用Oligo50來(lái)設(shè)計(jì)引物。(2) PCR基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、恰當(dāng)緩沖液（Mg2+）反映混合物中，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。這種擴(kuò)增是通過(guò)模板DNA、引物之間變性，退火（復(fù)性），延伸三步反映為一周期（cycle），循環(huán)進(jìn)行，使目DNA片段得以擴(kuò)增。由于每一周期所產(chǎn)生DNA片段均能成為下一次循環(huán)模板，故PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增長(zhǎng)，經(jīng)30個(gè)周期后，特定DNA片段數(shù)量在理論上可

16、增長(zhǎng)109倍。在實(shí)際應(yīng)用中，普通多用3035個(gè)循環(huán)。(3)瓊脂糖電泳基本原理。 瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，于沸水中溶解，45開(kāi)始形成多孔性濾孔，凝膠孔徑大小決定于瓊脂糖濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)泳動(dòng)率就不同，從而分出不同區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，重要是運(yùn)用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射熒光強(qiáng)度大10倍以

17、上，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。2.實(shí)驗(yàn)辦法、環(huán)節(jié)和操作要領(lǐng)。(1) PCR擴(kuò)增。 先按單倍擴(kuò)增體系中各試劑量計(jì)算好n倍（除去模板DNA量）擴(kuò)增體系中各試劑相相應(yīng)量，然后在適合體積離心管中依次加入試劑（如n2.5 l 10PCR Buffer、n2 l dNTP，n4 l MgCl2、n0.5 l Forward primer、n0.5 l Reverse primer、n14.4 l ddH2O、n0.125 l Ex Taq酶，最后總體積為n24 l），經(jīng)離心混勻后，分裝至n個(gè)200l離心管中（涉及陰陽(yáng)性對(duì)照），在各管中加入模板DNA（如擴(kuò)增體系為25 l，則加入1 l模板DNA），混勻

18、后于PCR擴(kuò)增儀中按已設(shè)好PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。如細(xì)胞色素c氧化酶第一亞基(cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因擴(kuò)增體系為：試劑 體積（l） ddH2O 14.37510x PCR Buffer 2.5MgCl2 (25 mM)4.0dNTPs (2.5 mM each)2Forward primer (100 pmol/ml，JB3)0.5Reverse primer (100 pmol/ml，JB4.5)0.5Ex Taq (5 U/ml)0.125模板 (gDNA)1_ 總量25coxI基因PCR擴(kuò)增條件：94變性 5 min94變性30 s 5

19、5復(fù)性30 s 30個(gè)循環(huán)72延伸30 s72延伸5 min 擴(kuò)增完畢后，取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于4/-20冰箱保存?zhèn)溆谩?2) 瓊脂糖凝膠電泳。 制備凝膠：膠濃度視詳細(xì)狀況而定。以配制0.8%瓊脂糖凝膠為例，精確稱取0.8 g瓊脂糖加入至100 ml 0.5TBE電泳緩沖液，于微波爐中或經(jīng)高壓熔化均勻，冷卻至50左右，加入溴化乙錠（EB）（10 mg/ml，加入量為8.3 l EB/100 ml瓊脂糖凝膠液），混勻后倒入已封好凝膠灌制膠模中，插上樣品梳。待膠凝固后，從膠模上除去封帶，拔出梳子放入電泳槽中，加入足夠量電泳緩沖液（規(guī)定緩沖液液面高出凝膠表面約1 mm）。 點(diǎn)樣：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物35

20、l，與適量加樣緩沖液（Loading buffer，LB）混勻(若為6XLB，3-5 l擴(kuò)增產(chǎn)物加1 l 6X LB)，然后用取液器將樣品加入點(diǎn)樣孔中，同步設(shè)以適當(dāng)DNA分子量原則物（marker）作為參照。 電泳：接通電極，使DNA向陽(yáng)極移動(dòng)，在110 V/cm凝膠電壓下（慣用100 V）進(jìn)行電泳。當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段距離時(shí)，關(guān)閉電源。 成果觀測(cè)：將電泳好瓊脂糖膠置于紫外透射儀中，打開(kāi)紫外燈，若看到橙紅色核酸條帶，則闡明有擴(kuò)增PCR產(chǎn)物；依照條帶粗細(xì)，可粗略預(yù)計(jì)該條帶DNA量；依照已知分子量原則DNA對(duì)照，通過(guò)線性DNA條帶相對(duì)位置可初步預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物分子量。如果僅浮現(xiàn)

21、預(yù)期分子量大小條帶而無(wú)非特異性條帶，則闡明擴(kuò)增特異性較好。如果擴(kuò)增成果比較滿意，則用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，保存圖像。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化1.實(shí)驗(yàn)原理。 為驗(yàn)證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物種或株特異性，往往需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。為了建立種、株特異PCR診斷技術(shù)，需要擬定種、株特異遺傳標(biāo)記。在這樣狀況下，往往需要將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，然后經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。獲得純度高PCR產(chǎn)物是進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序前提條件。PCR產(chǎn)物純化辦法普通有兩種：一種是切膠回收，另一種是PCR產(chǎn)物直接回收。切膠回收原理就是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，將要回收目片段從凝

22、膠上切下來(lái)，然后再通過(guò)DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，以去除DNA樣品中除了目基因片段外所有雜質(zhì)。而PCR產(chǎn)物直接回收法則是將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物直接用PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。兩種辦法各有利弊，切膠純化純度較高，但回收率低；PCR產(chǎn)物直接純化，回收率高，但純度較低。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物很特異，且引物長(zhǎng)度不大于60 bp，則兩種辦法都可選用，但如果有非特異性條帶或引物長(zhǎng)度不不大于60 bp時(shí)，就必要用切膠純化辦法。2.實(shí)驗(yàn)辦法、環(huán)節(jié)和操作要領(lǐng)。(1) 切膠純化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式DNA膠回收試劑盒闡明進(jìn)行)： 取4050 1 PCR產(chǎn)物于0.8瓊脂糖凝膠中電泳約4050

23、 min（可恰當(dāng)縮短電泳時(shí)間以提高回收效率）。注意：必要將電泳槽用自來(lái)水充分沖洗，電泳緩沖液一定要換新鮮干凈，以保證不會(huì)有其他DNA污染。 于紫外透射儀中鋪上一塊新鮮保鮮紙，將凝膠放在保鮮紙上（以盡量提高DNA回收純度），打開(kāi)長(zhǎng)波紫外燈用干凈手術(shù)刀迅速將目片段從瓊脂糖凝膠上切下來(lái)（盡量去除多余瓊脂糖膠）。切下來(lái)膠塊放入一新鮮、滅菌1.5 ml離心管中，用電子天平稱重并作好記錄。 按每100 mg瓊脂糖凝膠或100 lDNA溶液加入400 l Binding buffer量來(lái)計(jì)算，加入相應(yīng)體積Binding buffer，混勻后置于5060水浴中10分鐘，使膠徹底融化（加熱融膠時(shí)，每2分鐘混勻一

24、次）。 將融化膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，用臺(tái)式離心機(jī)高速（8000 rpm）離心1 min。恰當(dāng)減少離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，加入500 l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。 重復(fù)環(huán)節(jié)“”一次。 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，高速離心（10000 rpm）1 min。 將UNIQ-10柱放入一新鮮干凈1.5 ml離心管中，在柱膜中央加30 l Elution Buffer或雙蒸水（pH7.

25、0）到UNIQ-10柱中，室溫或37放置2 min。（提高洗脫溫度至55-80有助于提高DNA洗脫效率） 10000 rpm高速離心1 min，離心管中液體即為回收DNA片段，可立雖然用或保存于-20備用。 取35 l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，瓊脂糖電泳檢查回收率，可依照帶亮度估算DNA回收純化后濃度。(2) PCR產(chǎn)物直接純化法（按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒闡明進(jìn)行）： 取PCR產(chǎn)物4050 l，加入3倍體積Binding buffer，混勻。 把混合液轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，用臺(tái)式離心機(jī)高速（800

26、0 rpm）離心1 min。恰當(dāng)減少離心轉(zhuǎn)速有助于提高DNA結(jié)合率。 倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500 l Wash solution，高速離心（10000 rpm）30 sec。 重復(fù)“”環(huán)節(jié)一次。 倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，高速離心（10000 rpm）1 min。 將UNIQ-10柱放入一根新鮮干凈1.5 ml離心管中，在柱膜中央加入30 l Elution Buffer或雙蒸水（pH7.0）到UNIQ-10柱中，室溫或37放置2 min（提高洗脫溫度至55-80有助于提高DNA洗脫效率）。 10000 rpm高速離心1 min，離

27、心管中液體即為回收DNA片段，可立雖然用或保存于-20備用。 取510 l PCR純化產(chǎn)物加適量加樣緩沖液混合，電泳檢查回收率，可依照帶亮度估算DNA回收純化后濃度。（六）動(dòng)物寄生蟲病特異PCR診斷技術(shù)實(shí)例以檢測(cè)雞柔嫩艾美爾球蟲感染為例，選用Fernandez等（）報(bào)道柔嫩艾美爾球蟲種特異引物(Tn-01-F：5-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3；Tn-01-R：5-CCGCCCAAACATGCAAGATGGC-3)，建立特異、敏感、迅速特異PCR診斷技術(shù)，用于雞柔嫩艾美爾球蟲感染診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。1PCR反映。 按常規(guī)辦法進(jìn)行，在0.2ml PCR管配制反映液，總體積為2

28、5L，其中：試劑 體積（l） 10x PCR Buffer 2.5MgCl2（25 mM）2.5dNTPs（2.5 mM each）2Forward primer（Tn-01-F，50 pmol/l）0.275Reverse primer（Tn-01-R，50 pmol/l）0.275ddH2O16.2rTaq （5 U/l）0.25_模板（gDNA）1同步設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。2反映在PCR儀上進(jìn)行。 反映條件為：96預(yù)變性5 min，然后94變性1min、65退火2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72后延伸7 min。3. 成果鑒定。 PCR產(chǎn)物在1.0%TBE瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，紫

29、外投射儀下觀測(cè)成果。陽(yáng)性對(duì)照可見(jiàn)分子量大小約530bp條帶；臨床樣品如有同樣大小條帶判為陽(yáng)性；陰性對(duì)照不見(jiàn)擴(kuò)增條帶。 四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)（一）寄生蟲基因組DNA提取及純化1操作中所使用鑷子和剪刀一定要事先滅菌并于超凈工作臺(tái)中紫外照射11.5 h，以保證沒(méi)有污染其他DNA。2吸取上清液時(shí)，應(yīng)注意勿將下層沉淀物吸入以免帶入雜質(zhì)，但也不要余下太多上清液，致使DNA損失較多。3整個(gè)操作過(guò)程中，一定要注意不要交叉污染。猶如步進(jìn)行各種蟲體DNA提取時(shí)一定要作好標(biāo)記。操作完畢后，臺(tái)面要用酒精擦拭多次；鑷子和剪刀經(jīng)清洗后先用酒精消毒，再用紫外燈照射12小時(shí)以破壞或降解殘存DNA，以免污染其他實(shí)驗(yàn)。（二）寄生蟲D

30、NAPCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳1在PCR擴(kuò)增操作過(guò)程中，一定要注意每加完一種試劑后，要換一次槍頭，以免試劑被污染，且加試劑時(shí)一定要注意不要加錯(cuò)、重加或漏加，最后加模板DNA時(shí)要用記號(hào)筆在管上作好標(biāo)記，以免成果混淆。2用微波爐煮膠時(shí)，膠液量不要超過(guò)三角瓶容量1/3，否則易溢出。3煮好膠應(yīng)冷卻至50左右時(shí)再倒入膠模中，以免膠模變形，并減少漏膠機(jī)會(huì)。4倒膠注意厚度（46 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10多分鐘，以加速膠凝固。5加樣前需趕走點(diǎn)樣孔中氣泡，點(diǎn)樣時(shí)吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整潔。6凝膠中具有EB（有潛在致癌性），不要直接用手接觸凝膠，操作時(shí)要戴上手套。廢棄膠應(yīng)集中解決，切勿亂丟。（三）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化1試劑盒初次使用前，必要按闡明書在Wash solution瓶中加入4倍體積無(wú)水乙醇，充分混勻后使用。每次使用后一定要將瓶蓋擰緊，以保持Wash solution中乙醇含量。2切膠回收時(shí)，于紫外透射儀中切膠時(shí)間應(yīng)盡量短，以減少凝膠在紫外光照射下時(shí)間。3. 切膠回收時(shí)，對(duì)于高濃度膠（1.52%），每100 mg凝膠加入700 l Binding buffer，融膠時(shí)間可以延長(zhǎng)到15分鐘，以保證凝膠所有融化。4. 切膠回收時(shí)瓊脂糖凝膠電泳