《分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用課件.ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用課件.ppt（44頁珍藏版）》請在匯文網(wǎng)上搜索。

1、分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用一、分子生物學(xué)在檢驗醫(yī)學(xué)中的常用技術(shù)1、PCR技術(shù)2、RT-PCR技術(shù)3、RFLP4、SSCP5、MSP6、測序二、外源性疾病的檢驗與診斷：1、細菌、支原體、衣原體、寄生蟲、病毒等2、SARS冠狀病毒的分子生物學(xué)檢測冠狀病毒的分子生物學(xué)檢測BNIoutS/BNoutAs:sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs:sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG anti

2、sense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bpSAR1s/SAR1as:sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bpAmplicon sequence(BNI-1,Bernhard-Nocht Institute,Hamburg,Germany)TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATC

3、ACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACCSARS-specific primers:Cor-p-F2(+)5CTAACATGCTTAGGATAATGG 3,Cor-p-F3(+)5

4、GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3,Cor-p-R1(-)5CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3,Product size:Cor-p-F2/Cor-p-R1:368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1:348 bpGovernment Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon,Hong Kong SAR Hong Kong-SAR China COR-1,COR-2:sense 5 CAC CGT TTC TAC AGG TTA

5、 GCT AAC GA 3 antisense 5 AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3 Product size:310 bpQueen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong-SAR ChinaHKU:sense 5 TACACACCTCAGCGTTG 3 antisense 5 CACGAACGTGACGAAT 3 Product size 182 bps二、內(nèi)源性疾病的檢驗與診斷：1、臨床基因變異酶的分子性質(zhì)研究1）用PCR-S

6、SCP技術(shù)發(fā)現(xiàn)我國第一例LDH遺傳變異病例病例21歲男性：LDH：75U/L(參考范圍：110-240U/L)其余指標均正常在三年的調(diào)查期間，LDH活力始終處于較低水平，在48-85U/L之間經(jīng)排除其它原因，如血中的抑制劑的存在、藥物的影響等可能因素外，我們懷疑可能有遺傳性的LDH變異。根據(jù)計算紅細胞中H、M亞基的比值，初步斷定為H亞基變異，采用合成的7對引物，分別擴增LDH基因中的7個外顯子，然后用SSCP電泳法與正常人對照，發(fā)現(xiàn)變異發(fā)生在外顯子4上，由此證明該病人的長期低酶活力是有基因變異引起的。2n23n34n45n56n62）LDH-A和LDH-B亞基遺傳變異及對檢驗結(jié)果的影響基因變異

7、可導(dǎo)致酶分子組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，對酶活力和酶的物理化學(xué)性質(zhì)造成影 響，可 給 臨 床 醫(yī) 生 造 成 診 斷 陷 阱(pitfall)，因為在不同疾病狀態(tài)下，從相關(guān)聯(lián)的組織器官中釋放出的酶與預(yù)期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各種疾病的狀態(tài)，容易造成誤診。LDH-A基因變異類型基因變異類型_變異位置DNA氨基酸置換影響A-171CGA-TGAArg-Ter無義突變A-328GAG-TAGGlu-Ter無義突變A-81GAC-AACAsp-Asn外顯子2丟失A-220AAA-GAALys-Glu電荷變化A-314CGT-TGTArg-Cys電荷變化A-20插入C移碼突變A-128TGTTGT-T

8、GTValVal-Val輔酶結(jié)合A-213丟失2bp(CT)移碼突變A-251丟失20bp移碼突變LDH-B基因變異類型基因變異類型變異位置DNA氨基酸置換影響B(tài)-6AAA-GAALys-Gly電荷變化B-35GCC-GAGAla-Glu輔酶結(jié)合B-1038bp重復(fù)移碼突變B-131AGT-CGTSer-Arg輔酶結(jié)合B-139丟失2bp(TC)移碼突變B-1454bp重復(fù)移碼突變B-147TAT-TAGTyr-Ter無義突變B-171CGC-CCCArg-Pro基質(zhì)結(jié)合B-172TTT-GTTPhe-Val基質(zhì)結(jié)合B-173CGC-CACArg-HisP軸的安定性B-176ATG-TTGMe

9、t-Leu分子穩(wěn)定性B-287丟失1bp(C)移碼突變B-320GAT-GTTAsp-Val電荷變化3)CK變異的分子性質(zhì)及對酶活力的影響病例56歲婦女，胸痛一天后被送入急診科心電圖和臨床癥狀提示AMI實驗室檢查：LDH6900U/L(200-400U/L)LDH-1/LDH-21.72CK37U/L(15-130U/L)CK-MB0U/LRT-PCR結(jié)果外顯子2殘基54處AGGACGGC天冬氨酸甘氨酸位于酶結(jié)構(gòu)的第4個-螺旋4）變異酶人群的檢驗結(jié)果不同于常規(guī)人群的檢驗結(jié)果結(jié)合臨床研究發(fā)現(xiàn)變異酶的檢驗結(jié)果與常人存在著顯著的差異，即這類人群發(fā)病前酶活力常低于正常人的參考范圍，發(fā)病時則上升至正常人

10、的參考范圍之內(nèi)，這個現(xiàn)象可能給臨床醫(yī)生正確診斷造成困難；1）2、2、電泳異常帶的分子性質(zhì)研究1）LDH異常電泳酶譜M4H1M3H2M2H3M1H4(+)LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1正常H缺失M缺失H變異(slow)H變異(fast)H發(fā)生變異時，產(chǎn)生H和hM4H1M3H2M2H3M1H4LD-5LD-4LD-3LD-2LD-1H1M3h1M3H2M2H4h2M2h1H3hHM2h2H2h3H1h42）異常電泳酶譜的分子性質(zhì)1）核苷酸的變異引起氨基酸的改變，2）變異后的氨基酸的酸堿性與變異前的氨基酸的酸堿性不同，3）變異的氨基酸位于分子的表面。結(jié)果：產(chǎn)生異常的電泳結(jié)果3）異常譜形的分

11、析方法LDH遺傳變異和非遺傳變異的分析流程圖血清（漿）同工酶分析（異常形式）紅細胞、白細胞同工酶分析正常譜型異常譜型免疫對流、固定、混合法鑒定遺傳變異（H或M亞基變異）（+）（-）LDH-Ig復(fù)合物腫瘤產(chǎn)生LDH基因分析LDHH/M比值的計算-LDH-1LDH-2LDH-3LDH-4LDH-5H亞基數(shù)43210M亞基數(shù)01234%ABCDE-計算方法：H=A+3/4B+2/4C+DM=100-HH/M=H/(100H)2、后生性調(diào)控標志物1、DNA甲基化-后生性調(diào)控的主要方式DNA甲基化是不改變基因序列，而是通過在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，從而調(diào)節(jié)基因的表達。2）啟動子甲基化作為新的分子診斷標志物的研究3）啟動子甲基化在分析LDH異常帶分子性質(zhì)中的首例應(yīng)用病例4歲兒童遺傳性Rb轉(zhuǎn)移到頸淋巴結(jié)血清LDH升高異常同工酶帶LD2ex位于LD1和LD2之間DNAmRNA1mRNA2aa0012345671234567