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1、分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用 湖南省疾病預(yù)防控制中心微 生 物 檢 驗(yàn) 科黃 一 偉分子診斷學(xué)分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測、構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。分子診斷學(xué)三個(gè)階段3 3個(gè)階段：個(gè)階段：（1 1）利用）利用DNADNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺

2、傳病的基因分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷；診斷；（2 2）以）以PCRPCR技術(shù)為基礎(chǔ)的技術(shù)為基礎(chǔ)的DNADNA診斷，特別是定診斷，特別是定量量PCRPCR和實(shí)時(shí)和實(shí)時(shí)PCRPCR的應(yīng)用，不僅可以檢測存在的應(yīng)用，不僅可以檢測存在于宿主的多種于宿主的多種DNADNA和和RNARNA病原體載量，還可檢病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細(xì)胞中測多基因遺傳病細(xì)胞中mRNAmRNA的表達(dá)量；的表達(dá)量；（3 3）以生物芯片（）以生物芯片（biochipbiochip）技術(shù)為代表的高）技術(shù)為代表的高通量密集型檢測技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基通量密集型檢測技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等。因

3、芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等。熒光定量熒光定量熒光定量熒光定量 PCRPCR（real-time PCR)real-time PCR)通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對對PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)物進(jìn)行標(biāo) 記跟蹤記跟蹤,實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算待測樣品的初始模板計(jì)算待測樣品的初始模板量。量。熒光定量熒光定量熒光定量熒光定量 PCRPCR儀儀儀儀 光定量光定量PCRPCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的系統(tǒng)的PCRPCR儀儀,通

4、常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。熒光定量熒光定量熒光定量熒光定量PCRPCR標(biāo)記方法標(biāo)記方法標(biāo)記方法標(biāo)記方法 內(nèi)摻式染料內(nèi)摻式染料SYBR GreenSYBR Green I 序列特異性探針序列特異性探針TaqmanTaqman Molecular BeaconsMolecular Beacons Dual Probes(Dual Probes(FRET)FRET)引物特異性探針引物特異性探針 AmplifluorAmplifluor(IntergenIntergen)5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Green ISY

5、BR-Green I Oligo 1:FluoresceinOligo 2:LC Red 640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（熒光共振能量傳遞（FRET Probe）RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitation雙標(biāo)記探針（雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）Taqman探針3端Q熒光分子能夠吸收5端R熒光分子發(fā)出的熒光,因此,正常情況下該探針檢測不到5端熒光分子發(fā)出的熒光,只能檢測到3端熒光分子的熒光信號,但當(dāng)溶液中有PCR 產(chǎn)物(模板)時(shí),探針與模板退火,即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物,從而激活Taq 酶的5外切酶活

6、性,將探針5端連接的R熒光分子從探針上切割下來,破壞了兩個(gè)熒光分子間的FRET,從而發(fā)出熒光,切割的R熒光分子數(shù)與PCR 產(chǎn)物的數(shù)量成比例,因此,根據(jù)PCR 反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始模板的數(shù)量熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer,FRET)RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)分子信標(biāo)（Molecular Beacon Probe）引物特異性探針（引物特異性探針（Amplisenor Probe）535353533RQ5RQRQ35QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針

7、（引物特異性探針（Amplifluor Probe）熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)PCRPCR與普通與普通與普通與普通PCRPCR的比較的比較的比較的比較 實(shí)時(shí)在線監(jiān)控實(shí)時(shí)在線監(jiān)控實(shí)時(shí)在線監(jiān)控實(shí)時(shí)在線監(jiān)控 對樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控對樣品擴(kuò)增的整個(gè)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增能夠?qū)崟r(shí)地觀察到產(chǎn)物的增加加,直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期直觀地看到反應(yīng)的對數(shù)期 降低反應(yīng)的非特異性降低反應(yīng)的非特異性降低反應(yīng)的非特異性降低反應(yīng)的非特異性 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合,提高了提高了PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)的特異的特異性性 增加定量

8、的精確性增加定量的精確性增加定量的精確性增加定量的精確性 全程監(jiān)控全程監(jiān)控,準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量 結(jié)果分析更加快捷方便結(jié)果分析更加快捷方便結(jié)果分析更加快捷方便結(jié)果分析更加快捷方便,無需跑膠無需跑膠無需跑膠無需跑膠 基因和蛋白質(zhì)芯片原理基因芯片(gene chip)也稱為DNA微距陣(DNAmicroarray)、DNA芯片(DNA chip)等。它是指將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相載體上，然后與待測的標(biāo)記樣品的基因按堿基互補(bǔ)配對原理進(jìn)行雜交，通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲取大量的信息。基因微陣列技術(shù)優(yōu)勢

9、 基因微陣列技術(shù)作為一種高通量的檢測新技術(shù),可以同時(shí)檢測數(shù)以萬計(jì)的生物分子，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)方面，其中包括病原生物的監(jiān)控和診斷。發(fā)現(xiàn)未知病原體。例如確定SARS-CoV應(yīng)用了基因微陣列技術(shù)。目前國內(nèi)外蛋白質(zhì)芯片或基因芯片產(chǎn)品目前國內(nèi)外蛋白質(zhì)芯片或基因芯片產(chǎn)品的進(jìn)展情況的進(jìn)展情況國外:賽弗吉生物系統(tǒng)公司（納斯達(dá)克代碼：CIPH）的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)已經(jīng)通過了中國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）的醫(yī)療設(shè)備審批。這也是廣譜儀器第一次在中國被批準(zhǔn)作為一種醫(yī)療設(shè)備使用。affymetrix 公司開發(fā)出測P53基因是否有突變以判斷患癌癥可能性的P53芯片，能診斷藥物代謝缺乏癥的細(xì)胞色素P450芯片.在

10、病原體的檢測方面,成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型肝炎病毒（HAV）、庚型肝炎病毒（HGV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、梅毒、弓形蟲、結(jié)核桿菌等多種病原體的診斷基因芯片.另外血液RD 等25 種紅細(xì)胞抗體系統(tǒng)以及高血壓病因,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）和人促黃體生成激素（hLH）等也都有了診斷基因芯片。在腫瘤方面,蛋白質(zhì)芯片已成功地應(yīng)用于診斷白血病、乳腺癌、心力衰竭等疾病的診斷,診斷用的抗體芯片有霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素B、蓖麻蛋白和枯草桿菌球體的診斷.最近，siemens公司、fraunhofer硅工藝研究院和infineon公司正在開發(fā)電化學(xué)生物芯片診斷系統(tǒng).國內(nèi):上海數(shù)康生物

11、科技有限公司研制開發(fā)的“多腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片診斷系統(tǒng)”于2001年12月獲得國家衛(wèi)生行政部門頒發(fā)的新藥證書和試生產(chǎn)批文。本實(shí)驗(yàn)室采用該診斷系統(tǒng)對12種腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199(CA199)、糖原242(CA242)、糖原(CA125)、糖原153(CA153)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、前列腺特異抗原(PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)、鐵蛋白(FER)、-人絨毛膜促性腺激素(-HCG)，人生長激素(HGH)含量進(jìn)行定量分析,測定9種腫瘤(如卵巢腫瘤,肝癌等).由上海裕隆生物科技有限公司及曲阜裕隆生物科技有限公司研發(fā)丙型肝炎病毒分片段抗體檢測

12、試劑盒（蛋白芯片）能夠同時(shí)檢測血清或血漿中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNS5以及上述四種抗體的總抗體5項(xiàng)指標(biāo)，突破了傳統(tǒng)的丙型肝炎酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測試劑盒一次只能檢測初篩指標(biāo)抗HCV總的局限，而采血量僅為ELISA法的1/5，具有丙型肝炎感染初篩和確診的雙重功能，并能反映丙型肝炎感染、治療和愈后狀況。此外，該試劑盒還具有檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高、平行性好、成本低、操作簡單快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。2004年6月24日獲國家食品藥品監(jiān)管局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國生物芯片技術(shù)向臨床免疫檢測領(lǐng)域的又一次成功突破。瑞芯生物科技有限公司已成功開發(fā)出乙型肝炎基

13、因多態(tài)性檢測芯片、丙型肝炎基因分型檢測芯片、結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片、地中海貧血癥檢測芯片等產(chǎn)品.建立基因芯片技術(shù)平臺探針設(shè)計(jì)探針制備探針點(diǎn)片樣本處理雜交條件標(biāo)記方法結(jié)果分析平行比較等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) RCA(Rolling Circle Amplification)LAMP(loop-mediated isothermalamplification)NASBA(Nucleic acid sequence-basedamplification，NASBA)未知病原體檢測新技術(shù) 高通量測序 DNADNA再（重）測序芯片 多重PCRPCR和質(zhì)譜聯(lián)用未知病原體檢測-高通量測序I IROCHE購買了454

14、GS 2.0，GS FLX454生命科學(xué)公司在測序過程中采用了納米材料，使測序速度提高了100倍。該生命科學(xué)公司利用皮升（picolitre）級反應(yīng)器進(jìn)行測序，雖然這種新的測序方法單個(gè)反應(yīng)的讀取堿基數(shù)和準(zhǔn)確率都不及毛細(xì)管電泳法，但是由于一次反應(yīng)數(shù)量巨大，所以總體上取得了高速的突破。150-200bp(GS 2.0),0.1GB300-500bp(GS FLX)1GB每小時(shí)600Mbp(100600Mbp(100倍SangerSanger法)一個(gè)人一臺機(jī)器100100天內(nèi)輕松地完成3030億bp(3G)bp(3G)ILLUMINA買了SOLEXA;Solexa技術(shù):Illumina Genome

15、 Analyzer測序儀基本原理：可逆性末端終結(jié)反應(yīng)四種堿基分別標(biāo)記四種不同熒光，每個(gè)堿基末端被保護(hù)基團(tuán)封閉，單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，該保護(hù)基團(tuán)被除去，下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行，如此反復(fù)，得出堿基的精確序列1735bp的序列1GBABI買了AGENCOURTSolid 系統(tǒng)寡核苷酸連接和檢測原理60bp4GB未知病原體檢測新技術(shù)-Affymetrix基因芯片技術(shù)Affymetrix基因芯片技術(shù)是基因芯片領(lǐng)域的國際行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),已經(jīng)為國際生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)、植物及微生物等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域廣泛認(rèn)可,利用該基因芯片技術(shù)作為主要研究手段之一在國際科學(xué)雜志發(fā)表的論文近4000篇,僅在Na

16、ture,Science和Cell等影響因子非常高的雜志發(fā)表的論文就數(shù)百篇.再測序芯片技術(shù)用于分子診斷舉例：1）勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室和防御科學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室利用AFFY基因芯片技術(shù)在9個(gè)小時(shí)內(nèi)一次鑒定3200種(微)生物.可以快速分類和定量分析環(huán)境樣品中的原核和真核(微)生物.2）美國CDC在利用AFFYMETRIX公司開發(fā)的天花病毒再測序芯片來鑒定和分類數(shù)以百計(jì)的天花病毒株系。通過對更多的分離物測序，科學(xué)家可以更容易地把病原體亞型和患者結(jié)果關(guān)連起來，并了解哪個(gè)亞型是毒力最強(qiáng)的等問題。3）Affymetrix和英國Health Protection Agency(HPA)共同開發(fā)了區(qū)分腦膜炎球菌不同株系的再測序芯片，芯片上代表了不同亞型腦膜炎球菌的基因組序列，可以成功分類以往方法可以分類的45個(gè)樣品，及把以往方法不能分類的12個(gè)樣品劃分到現(xiàn)有的腦膜炎球菌種類里，分析時(shí)間僅需要一天。4）Affymetrix正在開發(fā)生物反恐芯片，該技術(shù)可以鑒定National Institute of Allergy and Infectious Diseases(NIAID)圈定的最致命的26種細(xì)菌、10