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1、分子生物學基本研究法（上）分子生物學基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質操作技術及蛋白質操作技術第五章 0.01扉頁：扉頁：當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你當你進入實驗室時，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，的想象力，因為實驗操作中不能有一丁點兒的想象，否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本否則，你對事物的觀察就會受影響；當你翻開書本的時候，你又必須盡可能展開想象的的時候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀翅膀”，否，否則，你就不可能走在別人的前面。則，你就不可能走在別人的前面。0.02RNA基本操作技術基本操作技術真真核核生生物物基基因因組組DN

2、A龐龐大大，有有大大量量重重復復序序列列，很很難難直直接接分分離離得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNA來來自自反反轉轉錄錄的的mRNA，無無冗冗余余序序列列，通通過過篩篩選選cDNA文文庫庫，可可較較快快地分離到相關基因。地分離到相關基因。0.035.3 RNA基本操作技術基本操作技術5.3.1 總總RNA的提取的提取5.3.2 mRNA的純化的純化5.3.3 cDNA的合成的合成5.3.4 cDNA文庫的構建文庫的構建5.3.5 基因文庫的篩選基因文庫的篩選0.045.3.1 總總RNA的提取的提取細胞中的總細胞中的總RNA包括：包括：mRNA 1%5%rRNA 80%85%tRNA

3、sRNA15%20%0.05Trizol總總RNA提取試劑提取試劑 TIANGEN rRNA電泳后的三條特征性條帶電泳后的三條特征性條帶28S、18S、5S(特別是特別是28S和和18S特征性條帶特征性條帶)是鑒定總是鑒定總RNA純度純度和完整性的重要參數。和完整性的重要參數。0.06RNA的抽提方法 1.1.實驗室常用方法：實驗室常用方法：實驗室常用方法：實驗室常用方法：異硫氰酸胍苯酚抽提法異硫氰酸胍苯酚抽提法異硫氰酸胍苯酚抽提法異硫氰酸胍苯酚抽提法 TrizolTrizol試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞

4、細試劑：苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細胞結構，釋放細胞質及細胞核中的胞結構，釋放細胞質及細胞核中的胞結構，釋放細胞質及細胞核中的胞結構，釋放細胞質及細胞核中的RNARNA，并使核糖，并使核糖，并使核糖，并使核糖體蛋白與體蛋白與體蛋白與體蛋白與RNARNA分子分離，還能保證分子分離，還能保證分子分離，還能保證分子分離，還能保證RNARNA的完整。的完整。的完整。的完整。TrizolTrizol提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加提取步驟：首先在液氮中研磨材料，勻漿，加入入入入trizoltrizol試劑，再加

5、入氯仿抽提，分離水相，異丙醇試劑，再加入氯仿抽提，分離水相，異丙醇試劑，再加入氯仿抽提，分離水相，異丙醇試劑，再加入氯仿抽提，分離水相，異丙醇沉淀。沉淀。沉淀。沉淀。0.07RNA Extraction by TRIzol0.08使用BioSpcetrometer分光光度計進行快速檢測核酸0.09mRNA Extraction from Cell Culture0.010mRNA Extraction from Tissue0.0112.硅膠膜純化柱法硅膠膜純化柱法 將含有目的將含有目的RNA的細胞破碎液通過該的細胞破碎液通過該柱，柱，RNA吸附在硅膠膜上，然后在低鹽濃吸附在硅膠膜上，然后在低

6、鹽濃度下可從硅膠上直接洗脫度下可從硅膠上直接洗脫RNA。0.012RNA的濃度和純度的判斷：的濃度和純度的判斷：可通過測定其可通過測定其OD260和和OD280 OD2601時，相當于濃度為時，相當于濃度為40g/mL，當，當OD260/OD2801.82.0時，說明時，說明RNA純度純度較好。較好。0.0135.32.mRNA的純化寡聚（寡聚（dT）纖維素柱色譜法：）纖維素柱色譜法：利用利用mRNA3端含有端含有PolyA+的特點，當的特點，當RNA流經寡聚流經寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，用下，mRNA被特異性地結合在柱上，再用被特異性地結合在柱上，

7、再用低鹽溶液或蒸餾水洗脫低鹽溶液或蒸餾水洗脫mRNA。經過兩次此。經過兩次此柱可得到較高純度的柱可得到較高純度的mRNA.0.0140.015Promega PolyAT tract mRNA 分離系統(tǒng)分分離系統(tǒng)分離多聚離多聚(A)mRNA。將用生物素標記的寡聚。將用生物素標記的寡聚(dT)引物與細胞總引物與細胞總RNA共溫育，加入與微磁共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡球相連的抗生物素蛋白，用磁場吸附通過寡聚聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相引物與抗生物素蛋白及強力微磁球相連的連的mRNA。0.016圖圖5-14PolyATtractmRNA的分離的分離純化過程

8、簡圖。純化過程簡圖。0.017每個Oligotex Kit 包括用于結合poly A+mRNA的Oligotex 樹脂，和用于洗滌、洗脫結合的mRNA的離心柱。Oligotex mRNA Kits可從總RNA中純化mRNA，回收poly A+體外轉錄子。Oligotex Direct mRNA Kits 可從細胞和組織中純化mRNA。mRNA Extraction from Total RNA0.0185.3.3 cDNA的合成cDNA（complementary DNA）：在體外以mRNA為模板，利用反轉錄酶和DNA聚合酶合成的一段雙鏈DNA。0.019圖圖圖圖5-15 5-15 cDNAc

9、DNA合成過程合成過程合成過程合成過程示意圖。示意圖。示意圖。示意圖。第一鏈第一鏈第一鏈第一鏈cDNAcDNA的合成：的合成：的合成：的合成：以以以以mRNAmRNA為模板，反轉為模板，反轉為模板，反轉為模板，反轉錄成錄成錄成錄成cDNAcDNA，由反轉錄酶，由反轉錄酶，由反轉錄酶，由反轉錄酶催化，需引物（常用催化，需引物（常用催化，需引物（常用催化，需引物（常用oligooligo dTdT）。）。）。）。第二鏈第二鏈第二鏈第二鏈cDNAcDNA的合成：的合成：的合成：的合成：以第一鏈為模板，由以第一鏈為模板，由以第一鏈為模板，由以第一鏈為模板，由DNADNA聚合酶催化。聚合酶催化。聚合酶催

10、化。聚合酶催化。0.020圖圖圖圖5-16 5-16 cDNAcDNA合合合合成中的分子修飾。成中的分子修飾。成中的分子修飾。成中的分子修飾。0.021cDNA 的合成0.0225.3.4 cDNA文庫的構建cDNA文庫：文庫：是指將某種生物體基因組轉是指將某種生物體基因組轉錄的全部錄的全部mRNAmRNA經反轉錄產生的經反轉錄產生的cDNAcDNA片段片段分別與克隆載體重組，儲存于某種受體分別與克隆載體重組，儲存于某種受體菌中，該群體就稱該生物基因組的菌中，該群體就稱該生物基因組的cDNAcDNA文庫。文庫。0.023構建構建構建構建cDNAcDNA文庫的基本程序：文庫的基本程序：文庫的基本

11、程序：文庫的基本程序：mRNAmRNA的提取和純化。的提取和純化。的提取和純化。的提取和純化。合成合成合成合成cDNAcDNA第一鏈。第一鏈。第一鏈。第一鏈。將將將將mRNA-mRNA-cDNAcDNA雜交分子轉變?yōu)殡p鏈雜交分子轉變?yōu)殡p鏈雜交分子轉變?yōu)殡p鏈雜交分子轉變?yōu)殡p鏈cDNAcDNA分分分分子。子。子。子。將雙鏈將雙鏈將雙鏈將雙鏈cDNAcDNA重組到噬菌體載體或質粒載體上。重組到噬菌體載體或質粒載體上。重組到噬菌體載體或質粒載體上。重組到噬菌體載體或質粒載體上。將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒將重組

12、子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。0.024構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：0.025構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：0.026構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：構建基因組文庫的基本程序：0.027基因文庫的建立0.028基因組基因組DNADNA文庫文庫cDNAcDNA文庫文庫基因組基因組D

13、NADNA文庫與文庫與cDNAcDNA文庫的比較文庫的比較0.029基因組文庫與基因組文庫與cDNA文庫的差別文庫的差別基因組文庫中包含了所有基因，而基因組文庫中包含了所有基因，而cDNA文庫只包含表達的文庫只包含表達的基因，缺乏內含子和調控序列，在研究基因結構時用處不大基因，缺乏內含子和調控序列，在研究基因結構時用處不大cDNA文庫代表了文庫代表了mRNA的來源，轉錄本在豐度上有差別，的來源，轉錄本在豐度上有差別，而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列而基因組文庫在理論上均等地代表了所有基因序列不同細胞類型制備的不同細胞類型制備的cDNA文庫包含一些共同序列和獨特序文庫包含一些共同序列

14、和獨特序列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能列，可用于分離差別表達的基因，基因組文庫中不能基因組文庫由于含有不表達序列，比基因組文庫由于含有不表達序列，比cDNA文庫大文庫大mRNA在不同組織之間存在豐度差異，因此在不同組織之間存在豐度差異，因此cDNA文庫在構文庫在構建時對于建時對于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存含量較少的就比較困難，而基因組文庫不存在這樣的問題在這樣的問題0.0305.3.5 基因文庫的篩選基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子分子的特

15、定克隆過程。的特定克隆過程。0.0315.3.5.1 核酸雜交法0.0325.3.5.2 PCR篩選法前提：已知足夠的序列信息并獲得基因特前提：已知足夠的序列信息并獲得基因特異性引物。異性引物。步驟步驟：（：（1）將文庫保存在多孔培養(yǎng)板上將文庫保存在多孔培養(yǎng)板上 （2）用設計好的目的基因探針對每）用設計好的目的基因探針對每個孔進行個孔進行PCR篩選，鑒定出陽性孔篩選，鑒定出陽性孔 （3）把陽性孔中的克隆稀釋到次級）把陽性孔中的克隆稀釋到次級多孔板中進行多孔板中進行PCR篩選。篩選。（4）重復以上程序，直至鑒定出與）重復以上程序，直至鑒定出與目的基因對應的單個克隆為止。目的基因對應的單個克隆為止

16、。0.0335.3.5.3 免疫篩選法免疫篩選法原理：抗原抗體特異性結合原理：抗原抗體特異性結合適用于對表達文庫的篩選適用于對表達文庫的篩選文庫鋪于文庫鋪于文庫鋪于文庫鋪于E.coliE.coli形成噬形成噬形成噬形成噬菌斑菌斑菌斑菌斑轉移到硝酸纖維素膜轉移到硝酸纖維素膜轉移到硝酸纖維素膜轉移到硝酸纖維素膜保存原板加入一抗篩選膜上的噬菌斑印記保存原板加入一抗篩選膜上的噬菌斑印記保存原板加入一抗篩選膜上的噬菌斑印記保存原板加入一抗篩選膜上的噬菌斑印記吸收吸收吸收吸收噬菌體中噬菌體中噬菌體中噬菌體中表達的外源蛋白表達的外源蛋白表達的外源蛋白表達的外源蛋白洗去未結合的洗去未結合的洗去未結合的洗去未結合的抗體加入酶偶抗體加入酶偶抗體加入酶偶抗體加入酶偶聯(lián)的二抗聯(lián)的二抗聯(lián)的二抗聯(lián)的二抗E E加底物加底物加底物加底物顯色顯色顯色顯色 從保存板中挑從保存板中挑從保存板中挑從保存板中挑出陽性噬菌斑出陽性噬菌斑出陽性噬菌斑出陽性噬菌斑 0.034