1 1第第5章章 分子生物學(xué)研究法分子生物學(xué)研究法(上上)DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù) 5.1 重組重組DNA技術(shù)史話技術(shù)史話 5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) 5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) 5.4 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù) 5.5 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)2 2從從2020世世紀(jì)紀(jì)中中葉葉開開始始，分分子子生生物物學(xué)學(xué)研研究究得得到到高高速速發(fā)發(fā)展展，主主要要原原因因是是研研究究方方法法，特特別別是是基基因因操操作作和和基基因因工工程程技術(shù)的進(jìn)步。技術(shù)的進(jìn)步。基基因因操操作作主主要要包包括括DNADNA分分子子的的切切割割與與連連接接、核核酸酸分分子子雜雜交交、凝凝膠膠電電泳泳、細(xì)細(xì)胞胞轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化、核核酸酸序序列列分分析析以以及及基基因因人人工工合合成成、定定點(diǎn)點(diǎn)突突變變和和PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增等等，是是分分子子生生物物學(xué)學(xué)研究的核心技術(shù)。研究的核心技術(shù)?；蛞蚬すこ坛淌鞘侵钢冈谠隗w體外外將將核核酸酸分分子子插插入入載載體體分分子子，構(gòu)構(gòu)成成遺遺傳傳物物質(zhì)質(zhì)的的新新組組合合，使使之之進(jìn)進(jìn)入入原原先先沒沒有有這這類類分分子子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蛞蚬すこ坛碳技夹g(shù)術(shù)是是核核酸酸操操作作技技術(shù)術(shù)的的一一部部分分，強(qiáng)強(qiáng)調(diào)調(diào)外外源源核酸在另一種寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。核酸在另一種寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。3 35.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)史話技術(shù)史話分子生物學(xué)研究的起步主要表現(xiàn)在分子生物學(xué)研究的起步主要表現(xiàn)在3 3個方面：個方面：在在2020世世紀(jì)紀(jì)4040年年代代確確定定了了遺遺傳傳信信息息的的攜攜帶帶者者、即即基基因因的的分分子子載載體體是是DNADNA而而不不是是蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)，解解決決了了遺遺傳傳的的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。物質(zhì)基礎(chǔ)問題。在在2020世世紀(jì)紀(jì)5050年年代代提提出出了了DNADNA分分子子的的雙雙螺螺旋旋結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)模模型型和和半半保保留留復(fù)復(fù)制制機(jī)機(jī)制制，解解決決了了基基因因的的自自我我復(fù)復(fù)制制和和世世代交替問題。代交替問題。在在2020世世紀(jì)紀(jì)5050年年代代末末至至6060年年代代，相相繼繼提提出出了了“中中心心法法則則”和和操操縱縱子子學(xué)學(xué)說說，成成功功地地破破譯譯了了遺遺傳傳密密碼碼，闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。闡明了遺傳信息的流動與表達(dá)機(jī)制。4 4但但當(dāng)當(dāng)時時缺缺乏乏有有效效的的分分離離和和富富集集單單一一DNADNA分分子子的的技技術(shù)術(shù)，而無法對這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。而無法對這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。隨隨著著DNADNA分分子子體體外外切切割割與與連連接接及及核核苷苷酸酸序序列列分分析析技技術(shù)的進(jìn)步，推動了重組術(shù)的進(jìn)步，推動了重組DNADNA技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。重重組組DNADNA的的核核心心是是用用限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切核核酸酸酶酶和和DNADNA連連接接酶酶對對DNADNA分子進(jìn)行體外切割與連接。分子進(jìn)行體外切割與連接。工工具具酶酶的的發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)與與應(yīng)應(yīng)用用是是現(xiàn)現(xiàn)代代生生物物工工程程技技術(shù)術(shù)發(fā)發(fā)展展史史上上的重要事件的重要事件(見見P P167167表表5-1)5-1)。將將外外源源DNADNA和和載載體體分分子子重重組組成成雜雜種種DNADNA分分子子后后，還還必必須須通通過過轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化過過程程將將其其導(dǎo)導(dǎo)入入到到新新寄寄主主細(xì)細(xì)胞胞中中，才才能能保保證重組證重組DNADNA分子的增殖。分子的增殖。5 56 67 75.2 DNA5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)自自從從瓊瓊脂脂糖糖和和聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝膠膠被被引引入入核核酸酸研研究究以以來來，按按分分子子量量大大小小分分離離DNADNA的的凝凝膠膠電電泳泳技技術(shù)術(shù)，已已經(jīng)經(jīng)發(fā)發(fā)展展成成為為一一種種分分析析鑒鑒定定重重組組DNADNA分分子子及及蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)與與核核酸酸相相互作用的重要實(shí)驗手段。互作用的重要實(shí)驗手段。核核酸酸凝凝膠膠電電泳泳是是現(xiàn)現(xiàn)在在通通用用的的分分子子生生物物學(xué)學(xué)研研究究方方法法。是是DNADNA分分型型、DNADNA核核苷苷酸酸序序列列分分析析、限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切酶酶片片段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)。段分析以及限制酶切作圖等的技術(shù)基礎(chǔ)。凝膠的分辨率與凝膠的類型和濃度有關(guān)凝膠的分辨率與凝膠的類型和濃度有關(guān)(P(P174174表表5-2)5-2)。在在凝凝膠膠電電泳泳中中，一一般般要要加加入入溴溴化化乙乙錠錠(EB)(EB)染染色色。EBEB染色后的核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光。染色后的核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光。5.2.1 5.2.1 核酸凝膠電泳核酸凝膠電泳8 8核酸凝膠電泳的基本原理：核酸凝膠電泳的基本原理：某某種種分分子子在在特特定定的的電電場場中中，就就會會以以一一定定的的速速度度向向適適當(dāng)?shù)碾姌O移動。當(dāng)?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度稱為遷移率。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度稱為遷移率。遷遷移移率率與與電電場場強(qiáng)強(qiáng)度度成成正正比比，與與該該分分子子所所攜攜帶帶的的凈凈電電荷荷數(shù)數(shù)成成正正比比，而而與與分分子子的的磨磨擦擦系系數(shù)數(shù)成成反反比比(分分子子大大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等)。生生理理條條件件下下，核核酸酸分分子子中中的的糖糖-磷磷酸酸骨骨架架中中的的磷磷酸酸基基團(tuán)團(tuán)呈呈離離子子化化狀狀態(tài)態(tài)。把把核核酸酸分分子子放放置置在在電電場場當(dāng)當(dāng)中中，將會向電場的正極方向遷移。將會向電場的正極方向遷移。普普通通凝凝膠膠電電泳泳只只能能進(jìn)進(jìn)行行DNADNA小小片片段段分分離離，應(yīng)應(yīng)用用脈脈沖沖電場凝膠技術(shù)可進(jìn)行超大電場凝膠技術(shù)可進(jìn)行超大DNADNA片段的分離研究。片段的分離研究。9 9稱樣稱樣溶解溶解加熱加熱制板制板倒膠倒膠電泳操作基本程序電泳操作基本程序1010取樣取樣點(diǎn)樣點(diǎn)樣電泳電泳檢測檢測111112125.2.2 5.2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)細(xì)菌菌轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化是是指指一一種種細(xì)細(xì)菌菌菌菌株株由由于于捕捕獲獲了了來來自自另另一一種種細(xì)細(xì)菌菌菌菌株株的的DNADNA而而導(dǎo)導(dǎo)致致性性狀狀特特征征發(fā)發(fā)生生遺遺傳傳改改變變的的生生命命過程。過程。提提供供轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化DNADNA的的菌菌株株叫叫作作供供體體菌菌株株，接接受受轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化DNADNA的的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。處于能夠接受外源處于能夠接受外源DNADNA狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)菌轉(zhuǎn)化常用的方法：細(xì)菌轉(zhuǎn)化常用的方法：CaClCaCl2 2法和電擊法。法和電擊法。CaClCaCl2 2法法：將將快快速速生生長長中中的的大大腸腸桿桿菌菌置置于于經(jīng)經(jīng)低低溫溫(0)(0)預(yù)預(yù)處處理理的的低低滲滲氯氯化化鈣鈣溶溶液液中中，造造成成細(xì)細(xì)胞胞膨膨脹脹，膜通透性改變。膜通透性改變。電電擊擊法法：銳銳利利的的電電脈脈沖沖可可在在細(xì)細(xì)胞胞膜膜上上造造成成小小凹凹陷陷，再形成孔洞。再形成孔洞。13135.2.3 5.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)聚聚合合酶酶鏈鏈?zhǔn)绞椒捶磻?yīng)應(yīng)(PCR)(PCR)是是一一種種在在體體外外快快速速擴(kuò)擴(kuò)增增特特定定基因或基因或DNADNA序列的方法。序列的方法。PCRPCR體系的基本組成：體系的基本組成：超超純純水水、緩緩沖沖液液、MgMg2+2+、dNTPdNTP、DNADNA模模板板、引引物物、TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。PCRPCR的主要步驟的主要步驟(3(3步多次循環(huán)步多次循環(huán))：變變性性(9096)(9096)在在加加熱熱或或堿堿性性條條件件下下可可使使DNADNA雙雙螺螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNADNA，稱之為變性。，稱之為變性。退退火火(2565)(2565)是是模模板板與與引引物物的的復(fù)復(fù)性性。引引物物是是與與模模板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段板某區(qū)序列互補(bǔ)的一小段DNADNA片段。片段。延延伸伸(7075)(7075)結(jié)結(jié)合合在在特特定定DNADNA模模板板上上的的引引物物為為出出發(fā)發(fā)點(diǎn)點(diǎn)，將將四四種種脫脫氧氧核核苷苷酸酸以以堿堿基基配配對對形形式式按按5 5 33 的的方向沿著模板順序合成新的方向沿著模板順序合成新的DNADNA鏈。鏈。1414PCR擴(kuò)增原理擴(kuò)增原理引物引物引物引物5 5 5 5 3 3 3 3 延伸延伸延伸延伸變性、退火變性、退火變性、退火變性、退火延伸延伸延伸延伸變性、退火變性、退火變性、退火變性、退火15155.2.4 5.2.4 實(shí)時定量實(shí)時定量PCRPCR在在PCRPCR反反應(yīng)應(yīng)體體系系中中加加入入熒熒光光基基團(tuán)團(tuán)，利利用用熒熒光光信信號號累累積積實(shí)實(shí)時時監(jiān)監(jiān)測測整整個個PCRPCR進(jìn)進(jìn)程程，最最后后通通過過標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲曲線線對對未未知模板進(jìn)行定量分析的方法稱為實(shí)時定量知模板進(jìn)行定量分析的方法稱為實(shí)時定量PCRPCR。常常規(guī)規(guī)PCRPCR技技術(shù)術(shù)無無法法對對起起始始模模板板準(zhǔn)準(zhǔn)確確定定量量，無無法法對對擴(kuò)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時檢測增反應(yīng)實(shí)時檢測實(shí)實(shí)時時定定量量PCRPCR技技術(shù)術(shù)：利利用用熒熒光光信信號號的的變變化化實(shí)實(shí)時時檢檢測測PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增反反應(yīng)應(yīng)中中每每一一循循環(huán)環(huán)擴(kuò)擴(kuò)增增產(chǎn)產(chǎn)物物量量的的變變化化，通通過過CtCt值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增過過程程中中，擴(kuò)擴(kuò)增增產(chǎn)產(chǎn)物物的的熒熒光光信信號號達(dá)達(dá)到到設(shè)設(shè)定定的的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)稱為閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)稱為CtCt值。值。熒熒光光標(biāo)標(biāo)記記方方式式：非非特特異異性性熒熒光光標(biāo)標(biāo)記記(SYBR(SYBR Green)Green)和和特異性熒光標(biāo)記特異性熒光標(biāo)記(TaqTaqMan)Man)。16165.2.5 5.2.5 重亞硫酸鹽測序技術(shù)重亞硫酸鹽測序技術(shù)表表觀觀遺遺傳傳：基基因因的的DNADNA序序列列不不發(fā)發(fā)生生改改變變的的情情況況下下，基基 因因的的表表達(dá)達(dá)水水平平與與功功能能發(fā)發(fā)生生改改變變，并并產(chǎn)產(chǎn)生生可可遺遺傳傳的表型。的表型。表表觀觀遺遺傳傳學(xué)學(xué)：是是研研究究在在沒沒有有細(xì)細(xì)胞胞核核DNADNA序序列列改改變變的的情況時，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。情況時，基因功能的可逆的、可遺傳的改變。特征特征:可遺傳、可逆性、可遺傳、可逆性、DNADNA不變。不變。表表觀觀遺遺傳傳學(xué)學(xué)的的現(xiàn)現(xiàn)象象：DNADNA甲甲基基化化、組組蛋蛋白白修修飾飾、微微小小RNARNA、基因印記。、基因印記。DNADNA甲甲基基化化是是指指生生物物體體在在甲甲基基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶的的催催化化下下，以以S-S-腺腺苷苷甲甲硫硫氨氨酸酸為為甲甲基基供供體體將將甲甲基基轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到特特定定的的堿基上的過程。堿基上的過程。1717甲甲基基化化的的主主要要形形式式有有5-5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶、6-6-甲甲基基腺腺嘌嘌呤呤、7-7-甲基鳥嘌呤，真核生物主要發(fā)生于胞嘧啶。甲基鳥嘌呤，真核生物主要發(fā)生于胞嘧啶。DNADNA甲甲基基化化能能引引起起染染色色質(zhì)質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)、DNADNA構(gòu)構(gòu)象象、DNADNA穩(wěn)穩(wěn)定定性性及及DNADNA與與蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)相相互互作作用用方方式式的的改改變變，而而參參與與調(diào)調(diào)控許多重要的生物學(xué)現(xiàn)象和發(fā)育過程?？卦S多重要的生物學(xué)現(xiàn)象和發(fā)育過程。DNADNA甲基化將會抑制基因表達(dá)。甲基化將會抑制基因表達(dá)。DNADNA的的CpGCpG序序列列在在動動物物基基因因組組的的某某些些區(qū)區(qū)域域密密度度比比較較高高，形成形成CpGCpG島。島。哺哺乳乳動動物物基基因因組組中中約約有有4 4萬萬個個CpGCpG島島，CpGCpG島島常常位位于于基基因因啟啟動動子子區(qū)區(qū)或或第第一一個個外外顯顯子子區(qū)區(qū)，只只有有CpGCpG島島中中的的胞嘧啶能被甲基化。胞嘧啶能被甲基化。腫腫瘤瘤發(fā)發(fā)生生時時，抑抑癌癌基基因因CpGCpG島島以以外外的的CpGCpG序序列列非非甲甲基基化程度增加，而化程度增加，而CpGCpG島中則呈高甲基化狀態(tài)。島中則呈高甲基化狀態(tài)。1818實(shí)實(shí)驗驗中中常常用用重重亞亞硫硫酸酸鹽鹽測測序序法法來來確確定定某某個個堿堿基基位位點(diǎn)的甲基化情況，其主要過程點(diǎn)的甲基化情況，其主要過程(見見P P182182圖圖5-15)5-15)：將將待待測測DNADNA樣樣品品用用限限制制性性內(nèi)內(nèi)切切核核酸酸酶酶處處理理，或或用用超超聲波破碎成聲波破碎成5001000bp5001000bp的碎片。的碎片。重重亞亞硫硫酸酸鹽鹽處處理理使使DNADNA中中未未發(fā)發(fā)生生甲甲基基化化的的胞胞嘧嘧啶啶(C)(C)發(fā)發(fā)生生脫脫氨氨基基作作用用轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變變成成尿尿嘧嘧啶啶(U)(U)，甲甲基基化化后后的胞嘧啶不受影響。的胞嘧啶不受影響。PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增后后的的尿尿嘧嘧啶啶(U)(U)被被測測序序儀儀讀讀取取為為胸胸腺腺嘧嘧啶啶(T)(T)。對引物的選擇和設(shè)計要求非常高。對引物的選擇和設(shè)計要求非常高。參參考考原原始始序序列列即即可可判判斷斷原原C C位位點(diǎn)點(diǎn)是是否否甲甲基基化化，未未甲甲基化的基化的C C經(jīng)處理后成經(jīng)處理后成T T，甲基化的，甲基化的C C不變。不變。19195.2.6 5.2.6 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建從從生生物物組組織織細(xì)細(xì)胞胞提提取取出出全全部部DNADNA將將其其切切成成預(yù)預(yù)期期大大小小的的片片段段，分分別別與與載載體體連連接接，轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入受受體體細(xì)細(xì)菌菌或或細(xì)細(xì)胞胞，形形成克隆。成克隆。每每一一個個細(xì)細(xì)胞胞接接受受了了含含有有基基因因組組DNADNA中中的的某某個個片片段段與與載載體體連連接接的的重重組組DNADNA分分子子，而而且且可可以以繁繁殖殖擴(kuò)擴(kuò)增增，許許多多細(xì)細(xì)胞胞一一起起組組成成一一個個含含有有基基因因組組各各DNADNA片片段段克克隆隆的的集集合合體體，就稱為基因組就稱為基因組DNADNA文庫。文庫?；蛞蚪M組DNADNA文文庫庫可可用用于于分分離離特特定定的的基基因因片片斷斷、分分析析特特定定基基因因結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)、研研究究基基因因表表達(dá)達(dá)調(diào)調(diào)控控、還還可可用用于于全全基基因因組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測定。組物理圖譜的構(gòu)建和全基因組序列測定。202021215.3 RNA5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)細(xì)胞總細(xì)胞總RNARNA包括包括mRNAmRNA、rRNArRNA、tRNAtRNA、sRNAsRNA。典型動物細(xì)胞中：典型動物細(xì)胞中：mRNA 1%5%mRNA 1%5%，rRNA 80%85%rRNA 80%85%，tRNA 15%20%tRNA 15%20%。實(shí)驗室常用實(shí)驗室常用TrizolTrizol試劑提取總試劑提取總RNARNA。TrizolTrizol是是一一種種新新型型總總RNARNA抽抽提提試試劑劑，能能迅迅速速破破碎碎細(xì)細(xì)胞胞并并抑抑制制細(xì)細(xì)胞胞釋釋放放出出的的核核酸酸酶酶。主主要要成成分分是是苯苯酚酚，用用來來裂裂解解細(xì)細(xì)胞胞；還還加加有有8-8-羥羥基基喹喹啉啉、異異硫硫氰氰酸酸胍胍、-巰基乙醇等，用來抑制內(nèi)源和外源巰基乙醇等，用來抑制內(nèi)源和外源RNaseRNase。5.3.1 5.3.1 總總RNARNA的提取的提取2222將將組組織織在在液液氮氮中中磨磨碎碎，每每50100mg50100mg組組織織加加入入1ml 1ml TRIzolTRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。將將勻勻漿漿樣樣品品在在室室溫溫(1530)(1530)放放置置5 5分分鐘鐘，使使核核酸酸蛋蛋白白復(fù)復(fù)合合物物完完全全分分離離。每每使使用用1ml 1ml TRIzolTRIzol加加入入0.2ml0.2ml氯仿，振蕩氯仿，振蕩1515秒，室溫放置秒，室溫放置3 3分鐘。分鐘。28100002810000g g離離心心1515分分鐘鐘。樣樣品品分分三三層層：底底層層為為黃色有機(jī)相，黃色有機(jī)相，RNARNA在上層水相中和一個中間層。在上層水相中和一個中間層。水水相相轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移到到新新管管中中，每每使使用用1ml 1ml TRIzolTRIzol加加入入0.5ml0.5ml異丙醇異丙醇(沉淀水相中的沉淀水相中的RNA)RNA)，室溫放置，室溫放置1010分鐘。分鐘。28100002810000g g離離心心1010分分鐘鐘，離離心心后后在在管管側(cè)側(cè)和和管管底底出現(xiàn)膠狀出現(xiàn)膠狀RNARNA沉淀，棄上清。沉淀，棄上清。用用75%75%乙乙醇醇洗洗滌滌RNARNA沉沉淀淀。每每1ml 1ml TRIzolTRIzol加加1ml 1ml 75%75%乙乙醇醇。2828不不超超過過75007500g g離離心心5 5分分鐘鐘，棄棄上上清清。室溫放置干燥或真空抽干室溫放置干燥或真空抽干RNARNA沉淀。沉淀。THANK YOUSUCCESSvv2023/8/182023/8/182323可編輯可編輯24245.3.2 mRNA5.3.2 mRNA的純化的純化利利用用mRNA3mRNA3 端端含含有有poly(A)poly(A)的的特特點(diǎn)點(diǎn)，當(dāng)當(dāng)mRNAmRNA流流經(jīng)經(jīng)寡寡聚聚(dT)(dT)纖纖維維素素柱柱時時，在在高高鹽鹽緩緩沖沖液液作作用用下下，mRNAmRNA被被特異的吸附在寡聚特異的吸附在寡聚(dT)(dT)纖維素上。纖維素上。再再用用低低鹽鹽溶溶液液或或蒸蒸餾餾水水洗洗脫脫mRNAmRNA。經(jīng)經(jīng)過過兩兩次次寡寡聚聚(dT)(dT)纖纖維維素素柱，可得較純的柱，可得較純的mRNAmRNA。純純化化mRNAmRNA在在70%70%乙乙醇醇中中 -7070可保存一年以上。可保存一年以上。25255.3.3 cDNA5.3.3 cDNA的合成的合成cDNAcDNA的合成包括第一鏈和第二鏈的合成包括第一鏈和第二鏈cDNAcDNA的合成。的合成。第第一一鏈鏈cDNAcDNA的的合合成成是是以以mRNAmRNA為為模模板板，反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄為為cDNAcDNA，由由反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶催催化化，該該酶酶合合成成DNADNA時時需需要要引引物物引導(dǎo)，常用引物是寡聚引導(dǎo)，常用引物是寡聚(dT)(dT)。寡寡聚聚(dT)(dT)引引物物一一般般含含12201220個個脫脫氧氧胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷酸酸，后后面面再再加加一一個個連連接接引引物物(常常為為XhoXho酶酶切切位位點(diǎn)點(diǎn))以以便便于克隆構(gòu)建。于克隆構(gòu)建。第第二二鏈鏈cDNAcDNA的的合合成成以以第第一一鏈鏈為為模模板板，由由DNADNA聚聚合合酶酶催化。催化。262627275.3.4 cDNA5.3.4 cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建cDNAcDNA文文庫庫是是指指某某生生物物某某發(fā)發(fā)育育時時期期所所轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄的的全全部部mRNAmRNA經(jīng)經(jīng)反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄形形成成的的cDNAcDNA片片段段與與某某種種載載體體連連接接而而形形成成的的克隆的集合?？寺〉募稀NA分離富集分離富集 mRNA cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制復(fù)制 雙鏈雙鏈cDNA載體載體 重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌受體菌受體菌基本步驟：基本步驟：提取總提取總RNARNA。在在獲獲得得高高質(zhì)質(zhì)量量的的mRNAmRNA后后，反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄合成合成cDNAcDNA。合合成成接接頭頭的的加加入入，將將雙雙鏈鏈DNADNA克克隆到載體中去。隆到載體中去。分析分析cDNAcDNA片斷，擴(kuò)增片斷，擴(kuò)增cDNAcDNA文庫。文庫。對建立的對建立的cDNAcDNA文庫進(jìn)行鑒定。文庫進(jìn)行鑒定。28285.3.5 5.3.5 基因文庫的篩選基因文庫的篩選基基因因文文庫庫的的篩篩選選是是指指通通過過某某種種特特殊殊方方法法從從基基因因文文庫庫中鑒定出含有所需重組中鑒定出含有所需重組DNADNA分子特定克隆的過程。分子特定克隆的過程。篩篩選選方方法法有有很很多多種種，常常用用的的有有：核核酸酸雜雜交交法法、PCRPCR篩篩選法、免疫篩選法。選法、免疫篩選法。核核酸酸雜雜交交法法 常常用用放放射射性性標(biāo)標(biāo)記記的的特特異異DNADNA探探針針進(jìn)進(jìn)行行高高密度的菌落雜交篩選密度的菌落雜交篩選(見見P189P189圖圖5-21)5-21)。PCRPCR篩篩選選法法 在在已已知知序序列列信信息息并并獲獲得得基基因因特特異異引引物物時時，用用PCRPCR篩選法比較簡單。篩選法比較簡單。免免疫疫篩篩選選法法 基基于于抗抗原原抗抗體體特特異異性性結(jié)結(jié)合合的的原原理理，利利用表達(dá)載體所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫篩選。用表達(dá)載體所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫篩選。29295.4 5.4 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù)在在多多細(xì)細(xì)胞胞的的高高等等生生物物個個體體水水平平上上，人人們們用用克克隆隆(clone)(clone)表表示示由由具具有有相相同同基基因因型型的的同同一一物物種種的的兩兩個個或或數(shù)數(shù)個個個個體體組組成成的的群群體體。從從同同一一受受精精卵卵分分裂裂而來的單卵雙生子便是屬于同一克隆。而來的單卵雙生子便是屬于同一克隆。在在細(xì)細(xì)胞胞水水平平上上，克克隆隆一一詞詞是是指指由由同同一一個個祖祖細(xì)細(xì)胞胞分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。分裂而來的一群遺傳上同一的子細(xì)胞群體。在在分分子子生生物物學(xué)學(xué)上上，把把外外源源DNADNA插插入入具具有有復(fù)復(fù)制制能能力力的的載載體體DNADNA中中，使使之之得得以以永永久久保保存存和和復(fù)復(fù)制制，這這種種過程稱為克隆。過程稱為克隆。30305.4.1 RACE5.4.1 RACE技術(shù)技術(shù)cDNAcDNA末末端端快快速速擴(kuò)擴(kuò)增增法法(RACE)(RACE)是是用用于于從從已已知知cDNAcDNA片片段段擴(kuò)擴(kuò)增增全全長長基基因因的的方方法法，根根據(jù)據(jù)已已知知序序列列設(shè)設(shè)計計基基因因片片段段內(nèi)內(nèi)部部特特異異引引物物，由由該該片片段段向向外外側(cè)側(cè)進(jìn)進(jìn)行行PCRPCR擴(kuò)增得到目的序列。擴(kuò)增得到目的序列。用用于于擴(kuò)擴(kuò)增增5 5 端端的的方方法法稱稱為為5 5 RACERACE，用用于于擴(kuò)擴(kuò)增增3 3 端的稱為端的稱為3 3 RACERACE。已已知知cDNAcDNA序序列列可可來來自自序序列列表表達(dá)達(dá)標(biāo)標(biāo)簽簽、減減法法cDNAcDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。庫、差法顯示和基因文庫篩選。31315 5 RACERACE在在反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的作作用用下下，以以已已知知基基因因片片段段內(nèi)內(nèi)部部特特異異性性引引物物(GPS1)(GPS1)啟啟始始cDNAcDNA第第一一條條鏈鏈的的合合成成RNaseRNase降降 解解 模模 板板 mRNAmRNA，純純 化化cDNAcDNA第一條鏈。第一條鏈。用用末末端端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移酶酶在在cDNAcDNA鏈鏈3 3 端端加加dCdC，形成寡聚，形成寡聚(dC)(dC)尾巴。尾巴。以以連連有有寡寡聚聚(dG)(dG)的的錨錨定定引引物物(AP)(AP)和和基基因因片片段段內(nèi)內(nèi)部部特特異異引引物物(GPS2)(GPS2)進(jìn)進(jìn)行行PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增，以以期期得得到目的基因到目的基因5 5 端片段。端片段。32323 3 RACERACE在在反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄酶酶的的作作用用下下，以以連連有有可可以以和和polyApolyA配配對對的的寡寡聚聚(dT)(dT)的的錨錨定定引引物物啟啟始始cDNAcDNA第一條鏈的合成。第一條鏈的合成。RNaseHRNaseH降解模板降解模板mRNAmRNA。用用通通用用錨錨定定引引物物和和基基因因片片段段內(nèi)內(nèi)部部特特異異引引物物進(jìn)進(jìn)行行PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增增，以以期期得得到到目目的的基基因因3 3 端片段端片段。33335.4.2 5.4.2 應(yīng)用應(yīng)用cDNAcDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因cDNAcDNA差差示示分分析析法法(RAD)(RAD)充充分分發(fā)發(fā)揮揮了了PCRPCR能能以以指指數(shù)數(shù)形形式式擴(kuò)擴(kuò)增增雙雙鏈鏈DNADNA模模板板，僅僅以以線線形形形形式式擴(kuò)擴(kuò)增增單單鏈鏈模模板板的的特特性性，通通過過降降低低cDNAcDNA群群體體復(fù)復(fù)雜雜性性和和更更換換cDNAcDNA兩兩端端接接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片斷。頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片斷。試試驗驗材材料料(Tester(Tester T)T)和和探探針針材材料料(Driver(Driver D)D)在在接接受受差差示示分分析析前前均均經(jīng)經(jīng)