第五章第五章 分子生物學(xué)研究方法（上）分子生物學(xué)研究方法（上）.本章主要內(nèi)容本章主要內(nèi)容l 常見的常見的DNADNA操作技術(shù)操作技術(shù)l 基因克隆技術(shù)簡介基因克隆技術(shù)簡介l 蛋白質(zhì)組學(xué)及研究技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)及研究技術(shù).引言引言重組重組重組重組DNADNADNADNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件(1)(1)40404040年代，年代，年代，年代，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。確定了遺確定了遺確定了遺確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNADNADNADNA而不是蛋白質(zhì)。而不是蛋白質(zhì)。而不是蛋白質(zhì)。而不是蛋白質(zhì)。(2)(2)50505050年代，年代，年代，年代，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。建立了建立了建立了建立了DNADNADNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留復(fù)制機(jī)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留復(fù)制機(jī)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留復(fù)制機(jī)分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留復(fù)制機(jī)制。制。制。制。(3)(3)50505050年代末至年代末至年代末至年代末至60606060年代，相繼提出了年代，相繼提出了年代，相繼提出了年代，相繼提出了“中心法則中心法則中心法則中心法則”和和和和操縱子學(xué)說操縱子學(xué)說操縱子學(xué)說操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。.從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1970年年Mandel和和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收理后，能有效地吸收噬菌體噬菌體DNA。1972年，年，Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒胞同樣能夠攝取質(zhì)粒DNA。.基因工程的主要內(nèi)容或步驟基因工程的主要內(nèi)容或步驟基因工程的主要內(nèi)容或步驟基因工程的主要內(nèi)容或步驟 “分分分分-切切切切-連連連連-轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)-篩篩篩篩”（1 1 1 1）從基因組中）從基因組中）從基因組中）從基因組中分離分離分離分離、或、或、或、或PCRPCRPCRPCR擴(kuò)增、或人工合成帶有目的擴(kuò)增、或人工合成帶有目的擴(kuò)增、或人工合成帶有目的擴(kuò)增、或人工合成帶有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA片段。片段。片段。片段。（2 2 2 2）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e切割切割切割切割適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)妮d體分子和載體分子和載體分子和載體分子和含有目的含有目的含有目的含有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。（3 3 3 3）將目的基因）將目的基因）將目的基因）將目的基因連接連接連接連接到載體分子上，形成重組到載體分子上，形成重組到載體分子上，形成重組到載體分子上，形成重組DNADNADNADNA分子。分子。分子。分子。（4 4 4 4）將重組）將重組）將重組）將重組DNADNADNADNA分子分子分子分子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。（5 5 5 5）篩選篩選篩選篩選重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。再將目的基因克隆重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。再將目的基因克隆重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。再將目的基因克隆重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。再將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物。到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物。到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物。到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物。.基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征根本特征：具：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力。能力。19621962年年Arber Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，19671967年年GellertGellert發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了 DNA DNA 連接酶。連接酶。.重組重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶 酶酶 類類 功功能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNADNADNA連接酶連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)通過磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片段連接成一個(gè)片段連接成一個(gè)DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大腸桿菌）（大腸桿菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNADNA雙鏈中的缺口雙鏈中的缺口反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶按照按照RNARNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成DNADNA鏈鏈多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5-OH5-OH末端（進(jìn)行末端標(biāo)記末端（進(jìn)行末端標(biāo)記實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或用來進(jìn)行DNADNA的連接的連接末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的在雙鏈核酸的33末端加上多聚單核苷酸末端加上多聚單核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII從從DNADNA鏈的鏈的33末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸噬菌體噬菌體DNADNA外切酶外切酶從從DNADNA鏈的鏈的55末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA鏈鏈55或或33末端的磷酸基團(tuán)末端的磷酸基團(tuán) 科學(xué)家已幾乎能隨心所欲地把任何科學(xué)家已幾乎能隨心所欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。.1 DNA1 DNA操作技術(shù)操作技術(shù) DNADNA分子的切割與連接分子的切割與連接 核酸分子雜交核酸分子雜交 凝膠電泳凝膠電泳 細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化 核酸序列分析核酸序列分析 基因的人工合成基因的人工合成 基因的定點(diǎn)突變基因的定點(diǎn)突變 PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增 基因敲除基因敲除.1.1 1.1 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳原理：原理：種類：種類：瓊脂糖瓊脂糖（agaroseagarose）凝膠電泳；凝膠電泳；聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝膠電泳凝膠電泳用途：用途：鑒定重組鑒定重組DNADNA分子分子 蛋白質(zhì)與核酸相互作用蛋白質(zhì)與核酸相互作用 DNA DNA分型分型 DNA DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作圖限制酶酶切作圖.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨瓊脂糖凝膠分辨DNADNA片段的范圍為片段的范圍為0.2-50kb0.2-50kb之間之間.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為分辨范圍為1-10001-1000個(gè)堿基對(duì)個(gè)堿基對(duì).凝膠類型及濃度凝膠類型及濃度分離分離DNA片段的大小范圍（片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖瓊脂糖50 0001 000 0.7%瓊脂糖瓊脂糖20 0001 000 1.4%瓊脂糖瓊脂糖6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝膠的分辨能力同凝膠類型和濃度有關(guān)，凝膠凝膠的分辨能力同凝膠類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱?？紫毒驮龃螅浞直婺芰σ簿碗S之減弱。.1.2 1.2 轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)基因方法1.2.1 1.2.1 細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的方法細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的方法 (1)(1)結(jié)合（結(jié)合（conjugationconjugation）(2)(2)轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation）(常規(guī)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等常規(guī)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等)(3)(3)轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfectiontransfection）(4)(4)轉(zhuǎn)導(dǎo)（轉(zhuǎn)導(dǎo)（transductiontransduction）1.2.2 1.2.2 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)(1)顯微注射法：包括細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。顯微注射法：包括細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。(2)(2)電導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法電導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法 (3)(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法 (4)(4)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 (5)(5)精子載體法精子載體法1.2.3 1.2.3 植物轉(zhuǎn)基因的方法植物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)Ti (1)Ti質(zhì)粒介導(dǎo)質(zhì)粒介導(dǎo) (2)(2)電轉(zhuǎn)化法電轉(zhuǎn)化法 (3)(3)基因槍法基因槍法.1.3.1 1.3.1 放射性同位素技術(shù)放射性同位素技術(shù)同位素：同位素：原子序數(shù)相同而質(zhì)量不同的元素。原子序數(shù)相同而質(zhì)量不同的元素。放射性同位素放射性同位素 同位素可分為穩(wěn)定同位素和不穩(wěn)同位素可分為穩(wěn)定同位素和不穩(wěn)定同位素，后者又稱為放射性同位素。不穩(wěn)定同位定同位素，后者又稱為放射性同位素。不穩(wěn)定同位素原子核結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易自發(fā)產(chǎn)生衰變，產(chǎn)生素原子核結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易自發(fā)產(chǎn)生衰變，產(chǎn)生-射線、射線、-射線和射線和-射線等，同時(shí)從不穩(wěn)定同位素射線等，同時(shí)從不穩(wěn)定同位素變成穩(wěn)定同位素。在分子生物學(xué)研究中，得到應(yīng)用變成穩(wěn)定同位素。在分子生物學(xué)研究中，得到應(yīng)用的是放射性同位素。的是放射性同位素。1.3 1.3 核酸的分子雜交核酸的分子雜交.放射性的衰變類型放射性的衰變類型-射線：帶正電荷的高速粒子流射線：帶正電荷的高速粒子流-射線：帶負(fù)電荷的射線：帶負(fù)電荷的粒子流粒子流-射線：光子流射線：光子流 分子生物學(xué)研究中常用的放射性同位素及其性質(zhì)分子生物學(xué)研究中常用的放射性同位素及其性質(zhì)元素名稱元素名稱 半衰期半衰期 12.112.1年年 57005700年年 14.314.3天天 87.187.1天天 5.85.8年年14147 7N +N +1 10 0n n 14146 6C +C +1 11 1H H14146 6C C 14147 7N +N +0 0-1-1e e 2382389292U U 2062068282Pb +8Pb +84 42 2He+6He+60 0-1-1e (te (t1/2 1/2=4.510=4.5109 9a)a).放射性強(qiáng)度的探測放射性強(qiáng)度的探測（1 1）蓋革計(jì)數(shù)器（）蓋革計(jì)數(shù)器（Geiger counter tuberGeiger counter tuber），），閃爍計(jì)數(shù)器。閃爍計(jì)數(shù)器。（2 2）放射自顯影：）放射自顯影：X-X-光乳膠片覆蓋于樣品，在光乳膠片覆蓋于樣品，在黑暗中，黑暗中，-70-70，曝光。，曝光。放射性分子的制備放射性分子的制備：核物理，化學(xué)，生化反應(yīng)，：核物理，化學(xué)，生化反應(yīng)，生化分離技術(shù)生化分離技術(shù).核酸分子的放射性同位素標(biāo)記應(yīng)用舉例核酸分子的放射性同位素標(biāo)記應(yīng)用舉例 利用切口平移技術(shù)制備利用切口平移技術(shù)制備DNADNA放射性探針放射性探針.1.3.2 1.3.2 分子雜交類型分子雜交類型 根據(jù)鑒定對(duì)象不同，可將分子雜交法分為根據(jù)鑒定對(duì)象不同，可將分子雜交法分為3 3種類型：種類型：Southern雜交由E.M.Southern于1975年創(chuàng)立。SouthernSouthern雜交：雜交：將將將將DNADNADNADNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。NorthernNorthernNorthernNorthern雜交雜交：將將將將RNARNARNARNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。WesternWesternWesternWestern雜交雜交：將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素125125125125I I I I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。.1.3.3 1.3.3 核酸分子雜交核酸分子雜交復(fù)性（退火）：復(fù)性（退火）：在一定條件在一定條件下變性的兩條單鏈重新結(jié)合下變性的兩條單鏈重新結(jié)合為雙鏈的過程為雙鏈的過程雜交：雜交：來源不同的兩條單鏈來源不同的兩條單鏈結(jié)合為雙鏈分子的過程。結(jié)合為雙鏈分子的過程。核酸探針：核酸探針：指序列或功能特指序列或功能特性已知的標(biāo)記分子，為雙鏈性已知的標(biāo)記分子，為雙鏈或單鏈，長度通常為幾十至或單鏈，長度通常為幾十至幾百幾百bp,bp,包括包括DNADNA探針、探針、RNARNA探探針和針和cDNAcDNA探針。探針。若退火的核酸來自若退火的核酸來自不同的生物有機(jī)體，則不同的生物有機(jī)體，則所形成的雙鏈分子就被所形成的雙鏈分子就被稱為稱為雜種核酸分子雜種核酸分子。.（1 1）SouthernSouthern雜交（雜交（SouthernSouthern印跡）：印跡）：用適當(dāng)用適當(dāng)?shù)南拗泼赶郎y的限制酶消化待測DNADNA，電泳后，將凝膠浸于堿，電泳后，將凝膠浸于堿性溶液中以變性性溶液中以變性DNADNA，再經(jīng)毛細(xì)作用將變性的，再經(jīng)毛細(xì)作用將變性的DNADNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放射性同位素標(biāo)記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自射性同位素標(biāo)記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自顯影顯示雜交結(jié)果。該技術(shù)可有效地分析基因顯影顯示雜交結(jié)果。該技術(shù)可有效地分析基因結(jié)構(gòu)或檢測待測結(jié)構(gòu)或檢測待測DNADNA樣本中是否含有特定的序列。樣本中是否含有特定的序列。.1)1)電泳電泳:將已酶切的待檢將已酶切的待檢DNADNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。2)2)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜:將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到濾膜上（印跡轉(zhuǎn)移）。將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到濾膜上（印跡轉(zhuǎn)移）。3)3)雜交雜交:將濾膜與標(biāo)記的將濾膜與標(biāo)記的DNADNA或或RNARNA探針進(jìn)行雜交。探針進(jìn)行雜交。印跡法：印跡法：凝膠印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和凝膠印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。噬菌斑印跡法。雜交膜：雜交膜：尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜等。.放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交雜交模式圖雜交模式圖.某作者用人的一放射性某作者用人的一放射性DNADNA探針與鼠基因組探針與鼠基因組DNADNA進(jìn)行雜交，在所得到的雜交圖譜中，第進(jìn)行雜交，在所得到的雜交圖譜中，第1 1泳道的點(diǎn)泳道的點(diǎn)樣處有一略呈拖尾狀的放射性雜交斑點(diǎn)；第樣處有一略呈拖尾狀的放射性雜交斑點(diǎn)；第2 2泳道泳道呈較長的彌散形雜交帶；第呈較長的彌散形雜交帶；第3 3泳道有泳道有3 3條較清晰的雜條較清晰的雜交條帶，上下兩條帶的顯色程度相當(dāng)，中間的條帶交條帶，上下兩條帶的顯色程度相當(dāng)，中間的條帶顯色最深，約分別為其上下兩側(cè)條帶的兩倍。試分顯色最深，約分別為其上下兩側(cè)條帶的兩倍。試分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。例題：例題：.SouthernSouthern雜交應(yīng)用舉例雜交應(yīng)用舉例環(huán)狀芽孢桿菌基因啟動(dòng)子的分離與鑒定環(huán)狀芽孢桿菌基因啟動(dòng)子的分離與鑒定.環(huán)狀芽孢桿菌環(huán)狀芽孢桿菌C-2C-2基因啟動(dòng)子探針與重組基因啟動(dòng)子探針與重組DNADNA分子的斑點(diǎn)雜交分子的斑點(diǎn)雜交（2 2）斑點(diǎn)雜交）斑點(diǎn)雜交（Dot blotDot blot）：直接將）：直接將DNADNA樣品點(diǎn)在濾樣品點(diǎn)在濾膜上使之成為斑點(diǎn)，變性并固定，與探針雜交，放射膜上使之成為斑點(diǎn)，變性并固定，與探針雜交，放射自顯影。自顯影。.檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)（3 3）菌落原位雜交）菌落原位雜交（Hybridization in situ)Hybridization in situ)：又分又分為菌落雜交和空斑雜交。在雜交膜上接種轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，裂為菌落雜交和空斑雜交。在雜交膜上接種轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，裂解以釋放待檢解以釋放待檢DNADNA，變性并固定，變性并固定DNADNA，與探針雜交，放射自，與探針雜交，放射自顯影。顯影。用于鑒定陽性重組體。用于鑒定陽性重組體。.（4 4）組織原位雜交）組織原位雜交（Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridization）：）：指組織或細(xì)胞的原位雜交。經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透指組織或細(xì)胞的原位雜交。經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNADNA或或RNARNA雜交，以確定探針互雜交，以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置。補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置。Localization of RNA.1.4 1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction，PCRPCR）PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史1.4.1 PCR1.4.1 PCR原理原理 PCRPCR是一種體外無性擴(kuò)增是一種體外無性擴(kuò)增DNADNA的實(shí)驗(yàn)技的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。待擴(kuò)增術(shù)。待擴(kuò)增DNADNA片段經(jīng)高溫變性成為單鏈后，在低溫片段經(jīng)高溫變性成為單鏈后，在低溫（如（如5252）下與寡聚核苷酸引物退火，然后在中溫下）下與寡聚核苷酸引物退火，然后在中溫下以每一條單鏈為模板，由多聚酶催化延伸引物鏈，分以每一條單鏈為模板，由多聚酶催化延伸引物鏈，分別合成一條新鏈。經(jīng)過解鏈、退火和鏈延伸等多個(gè)循別合成一條新鏈。經(jīng)過解鏈、退火和鏈延伸等多個(gè)循環(huán)反應(yīng)，原環(huán)反應(yīng)，原DNADNA片段就可得到大量擴(kuò)增。片段就可得到大量擴(kuò)增。注注:TaqTaq來自來自Thermus aquaticusThermus aquaticus PCRPCR儀儀.1.4.2 PCR1.4.2 PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 Tmplate DNATmplate DNA DNA Primers DNA Primers dNTPs dNTPs Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 10 Buffer 10 Buffer1.4.3 1.4.3 基本反應(yīng)步驟基本反應(yīng)步驟 1 1個(gè)循環(huán)包括個(gè)循環(huán)包括高溫變性、低溫退火和中溫延伸高溫變性、低溫退火和中溫延伸反應(yīng)反應(yīng)。經(jīng)經(jīng)n n次循環(huán)后次循環(huán)后,一個(gè)一個(gè)DNADNA分子可分子可擴(kuò)增擴(kuò)增為為2 2n n個(gè)分子。個(gè)分子。.模板模板DNADNA的變性：模板的變性：模板DNADNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至9494左右左右一定時(shí)間后，使模板一定時(shí)間后，使模板DNADNA雙鏈解離，使之成為單雙鏈解離，使之成為單鏈，以便與引物結(jié)合。鏈，以便與引物結(jié)合。.Primer 1Primer 2535533 模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火(復(fù)性復(fù)性)：模板：模板DNADNA經(jīng)加熱經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至變性成單鏈后，溫度降至5555左右，引物與模板左右，引物與模板DNADNA單鏈上的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。單鏈上的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。335.Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物結(jié)合物在引物結(jié)合物在TaqTaq DNA DNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)原則，合成一條新的與模板按堿基配對(duì)原則，合成一條新的與模板DNADNA互補(bǔ)的鏈?；パa(bǔ)的鏈。.一般每完成一個(gè)循環(huán)需一般每完成一個(gè)循環(huán)需2-42-4分鐘，分鐘，2-32-3小時(shí)就能小時(shí)就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。1 1個(gè)個(gè)PCRPCR循環(huán)產(chǎn)生循環(huán)產(chǎn)生2 2條雙鏈分子條雙鏈分子.PCR的基本原理模板DNA.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)引物1引物2Taq酶Taq酶.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)TaqTaqTaqTaq.PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)第2輪結(jié)束.PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824第第1 1輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增第第2 2輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增第第3 3輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增第第4 4輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增第第5 5輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增第第6 6輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增.電泳分析電泳分析PCR設(shè)備.電泳分析電泳分析.（3 3）PCRPCR的應(yīng)用的應(yīng)用 反向反向PCRPCR：擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的未知DNADNA序列序列 錨定錨定PCR:PCR:用于測定基因結(jié)構(gòu)用于測定基因結(jié)構(gòu) 不對(duì)稱不對(duì)稱PCR:PCR:用于擴(kuò)增某一單鏈模板用于擴(kuò)增某一單鏈模板 RT-PCR(RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄-PCR):-PCR):逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合PCRPCR以擴(kuò)增以擴(kuò)增cDNAcDNA 復(fù)合復(fù)合PCR:PCR:用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條DNADNA片段片段 易錯(cuò)易錯(cuò)PCRPCR：引入引入錯(cuò)配錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致隨機(jī)突變堿基，導(dǎo)致隨機(jī)突變 熒光定量熒光定量PCR:PCR:用于估計(jì)模板用于估計(jì)模板DNADNA的濃度的濃度 免疫免疫PCRPCR：擴(kuò)增抗原擴(kuò)增抗原-抗體復(fù)合物上的抗體復(fù)合物上的DNADNA分子分子 原位原位PCRPCR：在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行在組織或細(xì)胞標(biāo)本片上直接進(jìn)行PCRPCR 微生物微生物PCR:PCR:用于微生物的鑒定和分類用于微生物的鑒定和分類.設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度：引物長度：15-30bp15-30bp，常為，常為20nt20nt左右。左右。引物擴(kuò)增跨度：以引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp200-500bp為宜。為宜。引物堿基：引物堿基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%為宜。避免為宜。避免5 5個(gè)以上個(gè)以上相同堿基的成串排列。相同堿基的成串排列。引物內(nèi)部應(yīng)避免出現(xiàn)出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引引物內(nèi)部應(yīng)避免出現(xiàn)出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)。物間互補(bǔ)。引物引物33末端堿基，應(yīng)與模板單鏈末端堿基，應(yīng)與模板單鏈嚴(yán)格嚴(yán)格配對(duì)。配對(duì)。引物中具有或能夠加上合適的酶切位點(diǎn)。引物中具有或能夠加上合適的酶切位點(diǎn)。特異性：與數(shù)據(jù)庫中的其它序列無明顯同源性。特異性：與數(shù)據(jù)庫中的其它序列無明顯同源性。.pPICZpPICZ物理圖譜物理圖譜 定向克隆應(yīng)用舉例定向克隆應(yīng)用舉例.Primer F：5-GCT GAA TTCGAA TTC ATG GGC AAC TCA GCG CTC GAC CTT-3Prim