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1、生72伍國(guó)羽2007012357環(huán)境中微生物的檢測(cè)和分離純化生72 伍國(guó)羽 2007012357組別 周四班 2-1-1實(shí)驗(yàn)同組人：王甦實(shí)驗(yàn)時(shí)間 2010年4月16日實(shí)驗(yàn)?zāi)康?) 熟悉常用微生物培養(yǎng)基配制與滅菌方法和原理;2) 掌握微生物的分離,純化;3) 用平板劃線法和稀釋法分離微生物;4) 認(rèn)識(shí)微生物存在的普遍性，理解無菌操作原理.實(shí)驗(yàn)原理微生物聚集最多的地方是土壤，土壤是各種微生物生長(zhǎng)繁殖的大本營(yíng)?？諝饫飸腋≈鵁o數(shù)細(xì)小的塵埃和水滴，它們是微生物在空氣中的藏身之地。各種水域中也有無數(shù)的微生物。居民區(qū)附近的河水和淺井水容易受到各種污染，水中的微生物就比較多。大湖和海水中，微生物較少。從人和動(dòng)

2、植物的表皮到人和動(dòng)物的消化道，也都經(jīng)常生活著大量的微生物。平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)器材實(shí)驗(yàn)材料: 菌源:土樣10g，大腸桿菌；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基24個(gè)；實(shí)驗(yàn)儀器: 取液器:1000ul 、200ul各一支，培養(yǎng)箱；實(shí)驗(yàn)試劑: 0.9% 無菌生理鹽水，250ml三角瓶中裝99ml生理鹽水，每瓶加約20粒玻璃珠；250ml三角瓶中99ml生理鹽水，作100倍稀釋用。

3、實(shí)驗(yàn)用具：平皿，涂棒，無菌200ul，1000ul吸頭，記號(hào)筆，酒精燈。實(shí)驗(yàn)步驟1) 采土樣：選擇肥沃土壤,去表層土,挖520cm深度的土壤數(shù)10g,裝入燒杯,帶回實(shí)驗(yàn)室;2) 制備土壤稀釋液;稱取土樣1.0g， 放入盛99ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用手振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液（10-2）。(全班統(tǒng)一做1份,分到每個(gè)小組1ml)。用200ul的無菌吸頭從中吸取0.1ml土壤懸液，注入事先分裝有0.9ml無菌水的試管中，吹吸3次，搖勻（10-3）。類推制得10-4、10-5、10-6的土壤懸液。3) 涂布。用無菌吸頭，分別吸取10-6 、 10-5 、 10-4濃度土壤稀釋

4、液100ul，較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板，編號(hào)為1、2、3。4) 涂板。單菌落劃線（2塊）：用接種環(huán)挑取大腸桿菌液，做單菌落劃線分離，每人2板。手指（1塊）：分別用未洗過的手指頭, 用自來水打濕的手指頭，用自來水洗過的手指頭，用洗手液洗過的手指頭 (不用毛巾擦)在同一平板的不同分區(qū)涂抹（用力一致）。頭發(fā)（1塊）：放置一根頭發(fā)，用無菌圖布棒壓緊在培養(yǎng)基上?？諝猓?塊）：打開培養(yǎng)皿置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（空氣中）10min，按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋1min。豆?jié){（1塊）：用永和豆?jié){涂板。泡菜水（1塊）：用前次實(shí)驗(yàn)制作泡菜的腌制水涂板。5

5、) 培養(yǎng)。將牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于35溫箱中培養(yǎng)24h；統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)。6) 統(tǒng)計(jì)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1） 土壤中微生物計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示：表1土壤稀釋液微生物計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋濃度菌落數(shù)平均值微生物濃度（個(gè)/g土壤）12310-418無法計(jì)數(shù)無法計(jì)數(shù)181.8X10610-5無法計(jì)數(shù)7無法計(jì)數(shù)70.7X10710-630無法計(jì)數(shù)1.51.5X107實(shí)驗(yàn)得到的菌落數(shù)較少，都偏離300太多，故誤差較大，三組得到的結(jié)果差別比較大。由于天氣尚寒冷，土壤中菌量還比較少，應(yīng)該使用更濃的土壤溶液涂板觀察計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大部分平板都無法計(jì)數(shù)，菌落部分長(zhǎng)成了一片或者長(zhǎng)得有較多菌落連在一起。這是涂板沒有

6、涂勻的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中使用的平板是新倒上凝結(jié)即時(shí)使用的，故含水量比較多，菌液滴加到培養(yǎng)基上不容易被培養(yǎng)基吸收，故涂板涂了很久之后依然有液體依附在培養(yǎng)基表面和涂布棒上，這樣長(zhǎng)出來的菌就會(huì)形成一片的菌斑。而如果菌液剩余不多，粘附在涂布棒上，當(dāng)將涂布棒拿離培養(yǎng)基的時(shí)候就會(huì)留下一條菌液痕，會(huì)長(zhǎng)出條狀的菌斑。建議實(shí)驗(yàn)改進(jìn)為提前一天由助教倒好一半數(shù)量的平板， 課堂上同學(xué)們學(xué)習(xí)倒另一半數(shù)量的平板使用，這樣也可以對(duì)比看到含水量較多的平板和含水量較少的平板的區(qū)別。2） 單菌落劃線圖1. 大腸桿菌單菌落劃線。用接種環(huán)挑取大腸桿菌液，做單菌落劃線分離，可以看到在菌液越來越少，在第四次劃線時(shí)出現(xiàn)了單菌落。3） 手指細(xì)菌測(cè)

7、試圖2. 手指上細(xì)菌測(cè)試。分別用未洗過的手指頭（1區(qū)）, 用自來水打濕的手指頭（4區(qū)），用自來水洗過的手指頭（2區(qū)），用洗手液洗過的手指頭 （3區(qū)）(不用毛巾擦)在同一平板的不同分區(qū)涂抹（用力一致）。（注意標(biāo)號(hào)是反的）可以看到未洗過的手指頭涂抹的區(qū)域菌落最少；用水打濕后菌落稍微有幾個(gè)；用自來水洗過的手指頭菌落密度和用洗手液洗過的幾乎一樣，菌落都非常多，而且有兩種，一種為白色，一種為黃色菌落。這并不表明沒洗過的手指頭最干凈。由于沒有水，所以干的指頭上的菌很難落下來到平板上，所以細(xì)菌都還粘在手指上。用水沾濕后會(huì)有少量的細(xì)菌脫落下來。而用水洗和用洗手液洗下的菌的密度相當(dāng)。單就細(xì)菌來講，如果手上沒有明

8、顯的污垢，用清水清洗會(huì)比用洗手液洗更健康，因?yàn)橄词忠豪锏幕瘜W(xué)物品會(huì)傷害皮膚。同時(shí)，洗手后應(yīng)該把水擦干更健康。4） 頭發(fā)細(xì)菌測(cè)試圖3. 頭發(fā)上細(xì)菌測(cè)試。放置一根頭發(fā)，用無菌圖布棒壓緊在培養(yǎng)基上?？梢钥吹筋^發(fā)上的細(xì)菌不算很多，只有幾個(gè)菌落。發(fā)現(xiàn)不管用桌子的黑底或者白紙的白底，都沒法將非常小的菌落拍的太清楚，而且如果相機(jī)里板子太遠(yuǎn)會(huì)沒法拍清楚，離得太近又擋光，依然拍不清楚很小的菌落。而且非常容易拍到燈光的高光點(diǎn)，導(dǎo)致看不清菌落。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)將平板豎起來，以白紙為背景但又不貼著白紙的時(shí)候可以將小菌落拍的非常清楚，而且此時(shí)相機(jī)與平板在一個(gè)水平線上，不會(huì)擋住平板的光線，這樣即使有高光點(diǎn)也依然能拍到菌落的陰影

9、，看的非常清楚。5） 空氣中落菌情況圖4. 空氣中細(xì)菌含量的測(cè)定。打開培養(yǎng)皿置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上（空氣中）10min，然后培養(yǎng)過夜看平板上長(zhǎng)菌情況?？梢钥吹酱蜷_了10分鐘后平板上落菌量并不多。說明實(shí)驗(yàn)室的空氣細(xì)菌比較少。6） 按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋1min。此塊平板未長(zhǎng)菌，說明實(shí)驗(yàn)中所使用的無菌操作方法是可行的。7） 永和豆?jié){中細(xì)菌測(cè)定。用100ul永和豆?jié){涂板后培養(yǎng)觀察其平板菌落情況。實(shí)驗(yàn)中此塊平板未長(zhǎng)菌。說明永和的豆?jié){衛(wèi)生狀況非常好。但有的同學(xué)做的出來的用豆?jié){涂的平板長(zhǎng)滿了菌落，這有可能是由于他們使用豆?jié){涂板的時(shí)間比較晚，豆?jié){已經(jīng)涼了放置了過長(zhǎng)時(shí)間，里面已經(jīng)開始生長(zhǎng)細(xì)菌了。本組實(shí)驗(yàn)使用

10、的豆?jié){都是熱的很新鮮，做了2塊平板用豆?jié){涂板都沒有長(zhǎng)菌。8） 泡菜水中細(xì)菌含量的測(cè)定。圖5. 泡菜水中細(xì)菌含量的測(cè)定。用100ul泡菜水涂板后培養(yǎng)觀察其平板菌落情況?？梢园l(fā)現(xiàn)平板上的菌落都比較小，但數(shù)量比較多。但在制作泡菜時(shí)為無氧發(fā)酵，所以這些好氧菌即使在瓶口處的泡菜水中少量存在也不會(huì)繁殖，故不會(huì)影響泡菜的質(zhì)量。思考題1) 你所取的土壤中細(xì)菌數(shù)量級(jí)為多少？土壤中細(xì)菌數(shù)量級(jí)為107。2) 從你周圍環(huán)境中微生物的觀察,你認(rèn)為無菌操作應(yīng)注意什么?無菌操作暴露無菌部分在空氣中的時(shí)間必須要短，暴露時(shí)需在酒精的的火焰旁邊。注意有菌的部分盡量不要接觸到無菌的部分。實(shí)驗(yàn)前需洗手并且擦干。進(jìn)行接種、劃線和涂布操

11、作的前后涂布棒和接種環(huán)應(yīng)在火焰上徹底滅菌，涂布時(shí)在酒精燈火焰處操作，打開培養(yǎng)皿的程度要盡可能小，涂棒能夠伸入涂勻即可。倒培養(yǎng)基時(shí)打開培養(yǎng)瓶后瓶口需在酒精燈上略加灼燒。3) 說明飯前洗手,飯后刷牙的重要性;從本次實(shí)驗(yàn)中看到手上存在大量微生物，其中有對(duì)人體有害的致病菌，而殘存在牙縫中的牙垢也適宜微生物生長(zhǎng)。洗手、刷牙可使清除手上微生物和牙垢，防止有害微生物在手上大量存在或在牙齒縫隙中大量生長(zhǎng)，非常重要。4) 在日常生活中如何講究飲食衛(wèi)生?飯前洗手,飯后刷牙，食物清洗干凈；餐具定期進(jìn)行消毒；不食用過期或者因長(zhǎng)期存放可能已經(jīng)被污染的食品，生、熟食分開存放，分刀具、砧板操作，生食要清洗干凈，熟食要加熱徹

12、底等等5) 試解釋夏天時(shí)煮好的飯如果放在鍋中保持蓋著鍋蓋不動(dòng)，不容易變質(zhì)，而一旦盛在碗里的飯就容易變質(zhì)，如果是吃剩的剩飯就最容易變質(zhì)的原因。蒸煮過的飯中不少細(xì)菌已經(jīng)被殺滅，在不開鍋蓋的情況下，和外界基本隔離，所以不容易受到外界環(huán)境中微生物的污染，因而不容易變質(zhì)。盛在碗里，和外界環(huán)境直接接觸，就容易被空氣中的細(xì)菌污染，容易變質(zhì)；吃剩的飯之前與人的唾液、餐具均有長(zhǎng)時(shí)間接觸，已經(jīng)含有大量、多種微生物，變質(zhì)速度最快。6) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，試批駁“潔僻行為”。從本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，我們?nèi)粘Ｉ钏幍沫h(huán)境中含有各種各樣的微生物，即便是在洗的非常干凈的手或者器物上，都含有大量的微生物。不論采取多么小心的衛(wèi)生習(xí)慣，也不可能完全清除或者殺滅這些細(xì)菌，在正常情況下，由于人體本身的免疫系統(tǒng)具有較強(qiáng)的抵御能力，這些微生物的存在并不會(huì)對(duì)人體造成傷害。因此，潔癖行為是沒有必要的。參考文獻(xiàn)1陳金春，陳國(guó)強(qiáng). 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 北京：清華大學(xué)出版社，20052Michael T. Madigan, John M. Martinko. Biology of microorganism. Eleventh edition. America: Pearson Prentice Hall, 20065