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1、細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)主講：黃小云.第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù).第一節(jié)第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法 光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy）電子顯微鏡技術(shù) (Electro microscopy)掃描遂道顯微鏡掃描遂道顯微鏡 (scanning tunneling microscope).第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法細(xì)胞組分的分析方法 離心分離技術(shù)離心分離技術(shù) 細(xì)胞內(nèi)核酸、

2、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法 特異蛋白抗原的定位與定性特異蛋白抗原的定位與定性 細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 放射自顯影技術(shù)放射自顯影技術(shù) 定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù).第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù) 細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng) 細(xì)胞工程細(xì)胞工程.一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（light microscopy)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù) 熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)（Fluorescence Microscopy）激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)激光共

3、焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser Confocal Microscopy）相差顯微鏡相差顯微鏡（phase-contrast microscope）微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡 （differential interference contrast microscope,DIC）.二、二、電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡技術(shù) 電子顯微鏡的基本知識電子顯微鏡的基本知識電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造 主要電鏡制樣技術(shù)主要電鏡制樣技術(shù)負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù) 掃描電鏡掃描電鏡（Scanning

4、electron microscope，SEM）SPM(Scanning probe microscope).三、三、掃描遂道顯微鏡掃描遂道顯微鏡Scanning Probe Microscope,SPM (80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器)包括：包括：STMSTM、AFMAFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等原理原理：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如：掃描探針與樣品接觸或達(dá)到很近距離時(shí)，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如 量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，量子力學(xué)中的隧道效

5、應(yīng)（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。并在計(jì)算機(jī)顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。裝裝置置：掃掃描描的的壓壓電電陶陶瓷瓷，逼逼近近裝裝置置，電電子子學(xué)學(xué)反反饋饋控控制制系系統(tǒng)統(tǒng)和和數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)采采集集、處處理理、顯顯示示系統(tǒng)。系統(tǒng)。特點(diǎn)：（特點(diǎn)：（1 1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為（側(cè)分辨率為0.10.10.2nm0.2nm，縱分辨率可達(dá)，縱分辨率可達(dá)0.01nm0.01nm）；）；（2 2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖

6、象，可測量厚度信息；）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3 3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。（4 4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。.普通復(fù)式普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)光學(xué)顯微鏡技術(shù) 光鏡樣本制作光鏡樣本制作分辨率分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離.熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)（Fluorescence Microscop

7、y）原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用 直接熒光標(biāo)記技術(shù)直接熒光標(biāo)記技術(shù) 間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記技術(shù) 在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì) 等生物大分子的定性定位：等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白如綠色熒光蛋白(GFP)的應(yīng)用的應(yīng)用 .激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理原理應(yīng)用：應(yīng)用：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率圖像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)?？芍貥?gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。.相差顯微鏡相差顯微鏡（phase-contras

8、t microscope）將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，可用于觀察活細(xì)胞觀察活細(xì)胞 微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡（differential-interference microscope）偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成 明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究 活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器錄像增差顯微鏡技術(shù)錄像增差顯微鏡技術(shù)（video-enhance microscopyvideo-enhance microscopy）計(jì)算機(jī)輔助的

9、計(jì)算機(jī)輔助的DIC顯微鏡可在高分辨率下研究活顯微鏡可在高分辨率下研究活 細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞中的顆粒及細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng).電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較電鏡與光鏡的比較 顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差.電鏡與光鏡光路圖比較電鏡與光鏡光路圖比較.電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本構(gòu)造.主要電

10、鏡制樣技術(shù)主要電鏡制樣技術(shù) 超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù) 用于電鏡觀察的樣本制備用于電鏡觀察的樣本制備示意圖示意圖 負(fù)染色技術(shù)負(fù)染色技術(shù)（Negative staining）與）與金屬投影金屬投影 染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)染色背景，襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)冰凍蝕刻技術(shù)（冰凍蝕刻技術(shù)（Freeze etching）（技術(shù)示意圖技術(shù)示意圖）冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒冰凍斷裂與蝕刻復(fù)型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒 和膜表面結(jié)構(gòu)。和膜表面結(jié)構(gòu)?？焖倮鋬隹焖倮鋬錾疃任g刻技術(shù)深度蝕刻技術(shù)（quick freeze deep etchingquick freeze deep e

11、tching）電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的 具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振 分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Structural BiologyStructural Biology）主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。.掃描電鏡掃描電鏡原理與應(yīng)用原理與應(yīng)用：電電子

12、子“探探針針”掃掃描描，激激發(fā)發(fā)樣樣品品表表面面放放出出二二次次電電子子，探測器收集二次電子成象。探測器收集二次電子成象。CO 2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張 力問題力問題.一、一、離心分離技術(shù)離心分離技術(shù) 用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物 差速離心差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分：分離密度不同的細(xì)胞組分 密度梯度離心密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離：精細(xì)組分或生物大分子的分離.二、二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法酶、糖與脂類等的顯示方法原理原理：利用一些顯色

13、劑與所檢測物質(zhì)中一些：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些 特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯 色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來 判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量分布和含量。Feulgen Staining.三、特異蛋白抗原的定位與定性三、特異蛋白抗原的定位與定性 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限 （圖圖）蛋白電泳蛋白電泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)與免疫印跡反應(yīng)與免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)(Western-Blot)免疫電

14、鏡技術(shù)免疫電鏡技術(shù)：免疫鐵蛋白技術(shù)免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù) 應(yīng)應(yīng)用用：通通過過對對分分泌泌蛋蛋白白的的定定位位，可可以以確確定定某某種種蛋蛋白白的的分分泌泌動(dòng)動(dòng)態(tài)態(tài)；胞胞內(nèi)內(nèi)酶酶的的研研究究；膜膜蛋蛋白白的的定定位位與與骨骨架架蛋蛋白白的的定位等定位等.四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 光鏡水平的原位雜交技術(shù)光鏡水平的原位雜交技術(shù) （同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)電鏡水平的原位雜交技術(shù)（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相

15、連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）PCR技術(shù)技術(shù) .五、放射自顯影技術(shù)五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：原理及應(yīng)用：利利用用同同位位素素的的放放射射自自顯顯影影，對對細(xì)細(xì)胞胞內(nèi)內(nèi)生生物物大大分分子子進(jìn)進(jìn)行行定性、定位與半定量研究；定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）放射自顯影放射自顯影.六定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)六定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù) 細(xì)胞顯微分光光度術(shù)細(xì)胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸

16、收，測定這些物質(zhì)利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì) （如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。包括：包括：紫外光顯微分光光度測定法紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry）主要應(yīng)用主要應(yīng)用：用于定量測定細(xì)胞中的用于定量測定細(xì)胞中的DNADNA、RNARNA或某一特異蛋白的含量；或某一特異蛋白的含量；測定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；測定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離分離DNADNA含量不同的

17、中期染色體。含量不同的中期染色體。.一、細(xì)胞的培養(yǎng)一、細(xì)胞的培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（類型：原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary culture cellprimary culture cell）繼代培養(yǎng)細(xì)胞（繼代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culture cellsub-culture cell）細(xì)胞株（細(xì)胞株（cell straincell strain）正常二倍體，接觸抑制正常二倍體，接觸抑制 細(xì)胞系細(xì)胞系（cell linecell line）亞二倍體，接觸抑制喪失亞二倍體，接觸抑制喪失植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng) 類型類型：原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng) （體細(xì)胞培養(yǎng)）（體細(xì)胞培養(yǎng)）單

18、倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）單倍體細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）非細(xì)胞體系（非細(xì)胞體系（cell-free systemcell-free system）.二、細(xì)胞工程二、細(xì)胞工程 細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cell fusion）與細(xì)胞雜交（）與細(xì)胞雜交（cell hybridization）技術(shù)）技術(shù)單克隆抗體（單克隆抗體（monoclone antibodymonoclone antibody）技術(shù)）技術(shù) 圖圖細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)細(xì)胞拆合與顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)物理法結(jié)合顯微操作技術(shù)(圖圖1 1、圖圖2 2)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)化學(xué)法結(jié)合離心技術(shù)制備核體（制備核體（karyoplastkaryop

19、last）和胞質(zhì)體（）和胞質(zhì)體（cytoplastcytoplast）。）。其它技術(shù)其它技術(shù) 遺傳分析（遺傳分析（mutant,knock out,knock in）對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸瓶頸.對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸對細(xì)胞生命活動(dòng)的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的瓶頸細(xì)胞生命活動(dòng)突變體分析突變體分析蛋白修飾分析基因表達(dá)多肽定性分析生物信息學(xué)序列測定雙向電泳分析DNA分離與克隆機(jī)器人技術(shù) (robotics)功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)分離與制備 蛋白質(zhì)組學(xué).Hela細(xì)胞（左）、CHO細(xì)胞（右）的培養(yǎng).