Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology第二章 細胞生物學研究技術李蓮軍 博士云南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院2003.9-2010.9Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 生命科學是實驗科學，它的很多成果都是通過實驗才得以發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的。許多細胞生物學的重要進展以及新概念的形成，往往來自新技術的應用。因此，方法上的突破，對于理論和應用上的發(fā)展具有巨大的推動作用。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology第一節(jié)顯微鏡技術 第二節(jié)細胞成分分析技術 第三節(jié)細胞組分分離技術 第四節(jié)細胞分選技術 第五節(jié)細胞工程技術 第六節(jié)分子生物學技術學習內(nèi)容Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、光學顯微鏡技術 (light microscopy)第一節(jié) 顯微鏡技術二、電子顯微鏡技術 (electron microscopy)觀察細胞及其組分的形態(tài)和結構。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 顯微鏡成像三要素:照明系統(tǒng)，被觀察的樣品，聚焦和成像的透鏡系統(tǒng) 一、顯微鏡成像基本原理 在光學顯微鏡中，照明系統(tǒng)是可見光，使用的是玻璃透鏡系統(tǒng)，可直接通過目鏡觀察鏡像。在電子顯微鏡中，照明系統(tǒng)為電子束，使用電磁透鏡，通過熒光屏觀察樣品的鏡像。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology0.61 分辨率分辨率 DN.sin /2=:光源波長;:物鏡鏡口角;N:介質(zhì)折射率顯微鏡的分辨能力肉眼：0.2 mm;光鏡：0.2 um;電鏡：0.2 nmYunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology二、常用光學顯微鏡普通光學顯微鏡 倒置顯微鏡(inverted microscope)熒光顯微鏡(fluorescence microscope)相差顯微鏡(phase-contrast microscope)微分干涉相差顯微鏡(differential interference contrast microscope,DIC)暗視野顯微鏡(dark field microscope)激光共焦掃描顯微鏡(laser confocal microscope)Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology倒置顯微鏡 組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology相差顯微鏡 在結構上進行了特別設計，尤其是光學系統(tǒng)，將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，主要用于觀察體外培養(yǎng)中活細胞的形態(tài)結構。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強烈的紫外線光源，用于觀察細胞中有自發(fā)熒光、誘發(fā)熒光或經(jīng)熒光染料標記的結構。熒光顯微鏡 特點是：a 光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；b有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology微分干涉顯微鏡 偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細胞中較大的細胞器。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡(dark field microscope)的聚光鏡中央有當光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4200 nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，不分辨內(nèi)部的微細構造，適合于觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細菌和霉菌等。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 可對細胞內(nèi)部非侵入式光學斷層掃描成像，可進行一系列亞細胞水平的結構和功能研究。激光共聚焦掃描顯微鏡Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biologyu掃描電子顯微鏡 Scanning electron microscopy，SEMu透射電子顯微鏡 Transmission electron microscopy，TEM三、電子顯微鏡 電子顯微鏡觀察到的結構稱超(亞)微結構，可放大幾萬倍至幾十萬倍。u掃描隧道顯微鏡 Scanning tunneling microscope，STMYunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology1.觀察細胞內(nèi)部超微結構，分辨率 0.2 nm。2.用電子束穿透標本，經(jīng)電磁場的會聚和放大后在熒光屏上顯像或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼?.由于電子束穿透力弱，故經(jīng)固定后的電鏡標本需制成超薄切片(5080 nm)，并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色。4.標本制備：固定(戊二醛等)包埋(環(huán)氧樹脂)切片(50-80nm)染色(醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬鹽)。透射電鏡術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology掃描電鏡術 用于觀察細胞表面的立體細微結構。需將小塊組織經(jīng)固定、脫水、干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜或金屬膜。圖像清晰，富有立體感。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology儀器設備使用注意事項 使用前必須認真閱讀“說明書”，了解其工作原理和性能，按照“說明書”的要求進行操作，或在技術人員的指導下操作。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology第二節(jié) 細胞組分的分析方法 一、細胞化學技術二、免疫細胞化學技術三、核酸雜交技術四、放射自顯影技術 Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、細胞化學技術 主要用于顯示細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等。利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。如用過碘酸Schiff反應檢測多糖，用脂溶性染料顯示脂類，用酶化學染色顯示某種酶，用孚爾根反應顯示DNA。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology二、免疫細胞化學技術是應用免疫學原理，采用標記的抗原或抗體，通過抗原與抗體的特異性結合，然后用顯微鏡觀察標記物，顯示細胞內(nèi)的抗體或抗原(肽或蛋白質(zhì)等)的分布部位及相對含量。常用的標記物有辣根過氧化物酶、熒光素等，因此又可分為免疫酶技術、免疫熒光技術等。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology二種基本染色法 直接法：第一抗體被標記。間接法：第一抗體也被看作抗原，而第二抗體被標記。由于信號被放大，故靈敏度更高。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 是用標記的RNA或DNA探針檢測RNA或DNA片段的有無、及在轉(zhuǎn)錄水平檢測基因的活性(mRNA)的一種重要方法。三、核酸分子雜交技術 原理：具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology用核酸雜交技術檢測細胞內(nèi)某一基因在染色體上的定位，稱染色體原位雜交。用核酸雜交技術檢測某一基因或轉(zhuǎn)錄物mRNA在細胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)錄狀況，稱細胞原位雜交。原位雜交技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell BiologySouthern 雜交 是體外分析特異DNA序列的方法。操作時先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用標記的探針雜交，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology四、放射自顯影術 放射自顯影術(radioautography,autoradiography)用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、變化、作用機理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素標記物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，進行制片、放射性曝光、顯影、定影等處理，即得知標本中標記物的準確位置和數(shù)量。放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標記上放射性的化合物進行定位或相對定量測定。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology第三節(jié) 細胞成分的分離技術 分離技術是一大類技術的總稱，包括細胞亞結構的分離和生物大分子的分離。一、離心分離技術(centrifugation)二、層析分離技術(chromatography)Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、離心分離技術 離心分離細胞組分和生物分子是最常用的分離方法，因為不同的細胞器和生物分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。常用的兩類離心分離方法：u差速離心(differential centrifugation)u密度梯度離心(density gradient centrifugation)Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology細胞器及大分子的密度及其沉降系數(shù) Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology不同的細胞結構分離所需的離心力結 構離心力細胞核 800-1000 g線粒體 20，000-30，000 g葉綠體 20，000-30，000 g溶酶體 20，000-30，000 g微體 20，000-30，000 g粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 50，000-80，000 g質(zhì)膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 80，000-100，000 g游離核糖體、病毒粒子150，000-300，000 gYunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology差速離心 在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞器。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，差速離心只用于分離大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離，常需再通過密度梯度離心進一步分離純化。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology密度梯度離心 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一個連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞器分層、分離。又可分為速度沉降和等密度沉降兩種。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒(細胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。速度沉降Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。細胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞器分離。等密度沉降Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology二、層析分離技術 層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設計的物理分離方法。凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)離子交換層析(ion-exchange chromatography)親和層析(affinity chromatography)Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 凝膠過濾層析 又稱排阻層析或分子篩過濾，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化的一種方法。原理：蛋白質(zhì)的體積大小不一，凝膠上有大小不一的孔；大的蛋白質(zhì)在凝膠中不進入孔內(nèi)直接下來，速度最快，中等大小的進入大孔中，下來速度較慢，小的蛋白質(zhì)則進入小孔中，下來速度最慢。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。它以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 在生物分子中，有些分子的特定結構部位能夠同其他分子相互識別并結合，如酶與底物的識別結合、受體與配體的識別結合、抗體與抗原的識別結合，這種結合既是特異的，又是可逆的，改變條件可使這種結合解除，生物分子間的這種結合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設計的蛋白質(zhì)分離純化方法 親和層析Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、離心分選術二、流式細胞分選術三、免疫磁珠分選術四、電泳分選術第四節(jié) 細胞分選技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計(儀)(flow cytometer)。二、流式細胞術 Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology三、免疫磁珠法 磁珠可以結合蛋白質(zhì)，也可以被磁鐵吸引而發(fā)生力學移動。將微小磁珠用抗體(或抗原)包被后，使之與溶液中目的細胞表面的抗原(或抗體)特異性結合，再通過磁力作用發(fā)生力學移動，從而達到目的細胞與其他細胞(或物質(zhì))分離。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology四、細胞電泳 在一定pH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動，這種現(xiàn)象稱為細胞電泳(cell electrophoresis)。各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞電荷量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同，可用來分離不同種類的細胞。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 所謂細胞工程，就是應用細胞生物學和分子生物學的方法，對細胞進行操作。第五節(jié) 細胞工程技術 細胞工程基本技術主要包括：細胞體外培養(yǎng)、細胞融合、細胞器移植及基因轉(zhuǎn)移等。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、細胞體外培養(yǎng)技術二、細胞融合及單抗技術三、顯微操作技術四、干細胞技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 將離體細胞或組織放置在適當?shù)沫h(huán)境條件下進行培養(yǎng)，使其能生長并增殖的一種技術。用于檢測各種理化因子、細胞因子等對細胞形態(tài)結構、增殖、分化、代謝、運動、吞噬、分泌等生命活動的影響，還可用于研究細胞癌變及逆轉(zhuǎn)的機制，也可用于獲取特定的細胞、細胞產(chǎn)物等等。一、細胞培養(yǎng)技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology二、細胞融合技術 通過培養(yǎng)和誘導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合(cell fusion)或細胞雜交。相同基因型細胞融合成同核體(homokaryon)；不同基因型的雜交細胞則稱為異核體(heterokaryon)。動物細胞融合有以下三條途徑：1.病毒誘導融合；2.化學誘導融合；3.電激誘導融合。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology單克隆抗體技術 單克隆抗體(monoclone antibody)技術是細胞雜交技術的成功應用。正常淋巴細胞(如小鼠脾細胞)具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細胞(如骨髓瘤)可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。1975英國人Kohler和Milstein 將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術，獲1984年諾貝爾獎。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology單克隆抗體制備流程用特異抗原免疫小鼠(BALB/c)取脾臟漿細胞 鼠骨髓瘤細胞 細胞融合 篩選雜交瘤細胞 生產(chǎn)單克隆抗體Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology三、顯微操作技術 在顯微鏡下，用顯微操作儀對細胞進行解剖手術和微量注射的技術屬顯微操作技術。包括細胞核移植、嵌合體制作、細胞器移植、基因或染色體注入、胚胎切割、體外胚胎生產(chǎn)等。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology1 核移植(克隆動物)技術 細胞核移植技術，就是將供體細胞核移入除去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)過受精等有性過程(無性繁殖)即可被激活，構成新的重組胚胎，重組胚胎移植后，發(fā)育成與供體細胞基因型相同的后代，使得核供體的基因得到完全復制。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 嵌合體(chimeras)是指由不同基因型細胞構成的生物體。嵌合動物是指由兩種或兩種以上具有不同遺傳性質(zhì)的細胞系組成的聚合胚發(fā)育成的動物個體。嵌合動物技術是指由兩個或兩個以上同種或異種的受精卵組合發(fā)育而來的一個復合個體的制作技術。制作嵌合動物的方法主要有聚合法和囊胚注射法。2 嵌合動物技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology 聚合法是將2個或多個去除透明帶的早期胚胎，簡單地聚合在一起培養(yǎng)形成一個嵌合胚胎的過程。囊胚注射法是把細胞注射入囊胚腔中，囊胚經(jīng)培養(yǎng)進一步發(fā)育形成一個嵌合胚胎的過程。注射的細胞可以是卵裂球、內(nèi)細胞團細胞、ES細胞和EG細胞，甚至是已分化的細胞。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology3 染色體操作技術 按照人們的意圖，有計劃地削減、添加和替換染色體或其某一部分的方法和技術，以改變生物的遺傳基礎，達到人類需要的目的。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology四、干細胞技術 干細胞是一類能自我更新和分化為特殊種類細胞的細胞。干細胞被SCIENCE1999，2000及 2003年評為“十大科技進展之一”。干細胞技術主要包括：建立干細胞系，體外誘導分化，遺傳改造，移植、體外構建組織和器官等。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology干細胞分類胚胎性干細胞：胚胎干細胞ESs、胚胎生殖細胞EGs組織特異性干細胞：造血干細胞、肝干細胞、皮膚干細胞、全能干細胞：受精卵、卵裂球 專能干細胞：造血干細胞,精原干細胞,皮膚干細胞 多能干細胞：ESs、EGs；骨髓基質(zhì)干細胞按來源劃分按分化潛能劃分Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology第五節(jié) 分子生物學技術一、PCR技術二、基因工程技術三、轉(zhuǎn)基因動物技術Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology一、PCR技術 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)用于在體外將微量的目標DNA進行大量擴增，以便進一步分析或操作。反應體系：樣品DNA；引物(primer)；4種dNTP；Tag DNA聚合酶；適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反應過程：變性；復性；延伸；循環(huán)(重復上述“變性復性延伸”過程)。Yunnan Agricultural University.LlianMolecular Cell Biology溫度（溫度（溫度（溫度（）時間（時間（時間（時間（minmin）9494727260609494變性（變性（變性（變性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循環(huán)循環(huán)循環(huán)循環(huán)1 1 循環(huán)循環(huán)循環(huán)循環(huán)2 2 循環(huán)循環(huán)循環(huán)循環(huán)3 3 PCR PCR 反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNADNA變性、引物退火變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數(shù)是和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數(shù)是9494變性變性1min1min，60 60 退火退火1min1min，72 72 延伸延伸1.5min1.5min。如此周而復始，重。如此周而復始，重復進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。復進行，直至擴增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。PCR反應的溫度循環(huán)周期Y