第六章-免疫比濁分析(課堂PPT).ppt
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1、第六章第六章 免疫比免疫比濁分濁分析析1v 免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與免疫比濁分析是將液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)與現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合的一現(xiàn)代光學(xué)儀器和自動(dòng)分析技術(shù)相結(jié)合的一項(xiàng)分析技術(shù)。項(xiàng)分析技術(shù)。2第二節(jié)第二節(jié) 自動(dòng)化免疫比濁分析自動(dòng)化免疫比濁分析 第一節(jié)第一節(jié) 免疫比濁的原理免疫比濁的原理 一、透射免疫比濁法一、透射免疫比濁法 二、散射免疫比濁法二、散射免疫比濁法 三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法 四、免疫比濁分析的影響因素和臨床四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用應(yīng)用3第一節(jié)第一節(jié) 免疫濁度分析原理免疫濁度分析原理 抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng),形成小抗原、抗體在特定
2、的電解質(zhì)溶液中反應(yīng),形成小分子免疫復(fù)合物(分子免疫復(fù)合物(19S19S19S),使反),使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測(cè),用吸光度表應(yīng)液出現(xiàn)濁度。這種濁度可用儀器檢測(cè),用吸光度表示。示。4第一節(jié)第一節(jié) 免疫濁度分析原理免疫濁度分析原理 在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下,形成的免疫復(fù)在抗體稍微過(guò)量且固定的情況下,形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加,反應(yīng)液的濁度亦隨之合物量隨抗原量的增加而增加,反應(yīng)液的濁度亦隨之增大,即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。增大,即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。5免疫比濁技術(shù)分類:免疫比濁技術(shù)分類:透射免疫比濁法透射免疫比濁法(turbidimetric
3、 immunoassay)散射免疫比濁法散射免疫比濁法(nephelometry immunoassay)速率散射比濁法速率散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法終點(diǎn)散射比濁法67 一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶一定波長(zhǎng)的入射光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí),由于液時(shí),由于溶液溶液中的免疫復(fù)合物微粒對(duì)光線的吸收、中的免疫復(fù)合物微粒對(duì)光線的吸收、反射和折射而使透射光減少,可用反射和折射而使透射光減少,可用吸光度表示吸光度表示。在一定范圍內(nèi),吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相在一定范圍內(nèi),吸光度與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān),而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗關(guān),而形成的免疫復(fù)合物量與參與反應(yīng)的抗原和抗體的量呈函
4、數(shù)關(guān)系。體的量呈函數(shù)關(guān)系。一、免疫透射比濁法一、免疫透射比濁法(一)原理:(一)原理:8抗原抗體反應(yīng)曲線抗原抗體反應(yīng)曲線9 1.1.將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。(二)操作方法(二)操作方法 2.2.將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液(將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液(5 5個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品)個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品)與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合,在一定條件下,抗原抗體與適當(dāng)過(guò)量的抗血清混合,在一定條件下,抗原抗體反應(yīng)完成后,在反應(yīng)完成后,在340nm340nm處測(cè)定各管吸光度。處測(cè)定各管吸光度。3.按按log-logit轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)換或y=ax3+bx2+cx+d方程進(jìn)行曲線方程進(jìn)行曲線擬
5、合,制備劑量擬合,制備劑量-反應(yīng)曲線,由計(jì)算機(jī)處理,計(jì)算反應(yīng)曲線,由計(jì)算機(jī)處理,計(jì)算出抗原濃度。出抗原濃度。10待測(cè)的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大。待測(cè)的抗原抗體復(fù)合物分子量足夠大??乖贵w復(fù)合物數(shù)量足夠多??乖贵w復(fù)合物數(shù)量足夠多。具有充分的反應(yīng)時(shí)間,只能測(cè)定抗原抗具有充分的反應(yīng)時(shí)間,只能測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的第二階段。體反應(yīng)的第二階段。高親和力的抗體,并保證抗體過(guò)量。高親和力的抗體,并保證抗體過(guò)量。(三)技術(shù)要求(三)技術(shù)要求 11(四)方法評(píng)價(jià)(四)方法評(píng)價(jià) 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):靈敏度高,穩(wěn)定性好,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確靈敏度高,穩(wěn)定性好,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確 不足不足:抗體用量較大;抗體用量較大;溶液中存在
6、的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大溶液中存在的抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大 透射比濁測(cè)定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段,檢透射比濁測(cè)定在抗原抗體反應(yīng)的第二階段,檢 測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行,耗時(shí)較長(zhǎng)。測(cè)需在抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行,耗時(shí)較長(zhǎng)。12 粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后,微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散線照射后,微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素
7、密切相關(guān)。密切相關(guān)。二、免疫散射比濁法二、免疫散射比濁法(一一)原理原理13 不同大小的微粒形成的散射光分布不同。不同大小的微粒形成的散射光分布不同。當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長(zhǎng)的十分之一時(shí),當(dāng)微粒直徑小于入射光的波長(zhǎng)的十分之一時(shí),散射光的強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致散射光的強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致,稱,稱RayleighaeRayleighae散射。散射。當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長(zhǎng)時(shí),前當(dāng)微粒直徑大于或等于入射光的波長(zhǎng)時(shí),前向散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于后向散射光向散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于后向散射光,稱,稱MileMile散射。散射。1415 其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)和抗其中光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的
8、波長(zhǎng)和抗原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。原抗體復(fù)合物的大小和多少密切相關(guān)。當(dāng)固定檢測(cè)角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)時(shí),散射當(dāng)固定檢測(cè)角度與發(fā)射光的波長(zhǎng)時(shí),散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量成正比正比,即待測(cè)的抗,即待測(cè)的抗原越多,形成的復(fù)合物越多,散射光就越強(qiáng)。原越多,形成的復(fù)合物越多,散射光就越強(qiáng)。16 應(yīng)選擇應(yīng)選擇適當(dāng)適當(dāng)?shù)墓庠磸?qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度的光源強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間、測(cè)量角度及光源的波長(zhǎng)。及光源的波長(zhǎng)。另外,要注意保證抗原濃度合適。另外,要注意保證抗原濃度合適。此外,還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、此外,還要選擇適宜的離子強(qiáng)度、pHpH值等。值等。(二二)技術(shù)要求技術(shù)要求17 速率散射
9、比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一速率散射比濁法是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)種動(dòng)態(tài)測(cè)定方法。態(tài)測(cè)定方法。所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免所謂速率是指抗原抗體反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)形成免疫復(fù)合物的量(不是免疫復(fù)合物累積的量),連續(xù)測(cè)疫復(fù)合物的量(不是免疫復(fù)合物累積的量),連續(xù)測(cè)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)定各時(shí)間復(fù)合物形成的速率與其產(chǎn)生的散射光信號(hào)聯(lián)系在一起,形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法,每項(xiàng)檢測(cè)僅系在一起,形成動(dòng)態(tài)的速率散射比濁法,每項(xiàng)檢測(cè)僅12min即可完成。即可完成。(三三)速率散射比濁法速率散射比濁法(rate nephelometry)18累計(jì)時(shí)間復(fù)合物產(chǎn)生總量產(chǎn)生速率510
10、152025303540455055608132560150230300360415450480500512359080706055453020 抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)間與速率的關(guān)系19 當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí),當(dāng)抗體的濃度固定于一定范圍時(shí),復(fù)合物復(fù)合物形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比,形成的速率峰值的高低與抗原的含量成正比,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),免疫復(fù)合物的量逐漸增隨著時(shí)間的延長(zhǎng),免疫復(fù)合物的量逐漸增多,多,抗原抗體結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)??乖贵w結(jié)合速度的峰值在一定的時(shí)間出現(xiàn)。通過(guò)微機(jī)處理即可得到待測(cè)蛋白成份的含量。通過(guò)微機(jī)處理即可得到待測(cè)蛋白
11、成份的含量。2021 速率散射比濁法速率散射比濁法峰值出現(xiàn)的時(shí)間峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體濃與抗體濃度及純度直接相關(guān),需選用抗體純度及親和力交度及純度直接相關(guān),需選用抗體純度及親和力交高的試劑。高的試劑。此外,要保證待測(cè)樣本血清的性狀符合要此外,要保證待測(cè)樣本血清的性狀符合要求,如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。求,如嚴(yán)重脂血等即為不合格樣本。技術(shù)要求技術(shù)要求22(三三)方法評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià) 散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法,本散射比濁法是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法,本法自動(dòng)化程度高,具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密法自動(dòng)化程度高,具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、精密等優(yōu)點(diǎn)。采用抗原過(guò)量檢測(cè)方法,保證了結(jié)果的等優(yōu)點(diǎn)。采
12、用抗原過(guò)量檢測(cè)方法,保證了結(jié)果的準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴準(zhǔn)確性。但儀器和試劑價(jià)格比較貴,對(duì)抗體的質(zhì)對(duì)抗體的質(zhì)量要求很高。量要求很高。23 用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒粒(一般為(一般為0.2 m),),在遇到相應(yīng)抗原時(shí),膠乳在遇到相應(yīng)抗原時(shí),膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合,引起膠乳顆粒凝顆粒上的抗體與抗原特異結(jié)合,引起膠乳顆粒凝聚聚,使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。,使透射光和散射光即出現(xiàn)顯著變化。三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法(一)(一)原理:原理:24三、免疫膠乳比濁法三、免疫膠乳比濁法(一)(一)原理:原理:25第二節(jié)第二節(jié)
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