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1、微生物檢驗(yàn)方法微生物檢驗(yàn)方法第五小組第五小組1一、總則一、總則二、菌落總數(shù)二、菌落總數(shù)三、糞大腸菌群三、糞大腸菌群四、霉菌和酵母菌四、霉菌和酵母菌2一、總則一、總則1.1.范圍范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。的基本要求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。保存及供檢樣品制備。2.2.儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備天平天平 高壓滅菌器高壓滅菌器振蕩器振蕩器 三角瓶三角瓶(250mL)(250mL)玻璃珠玻璃珠 玻璃棒玻璃棒刻度吸管刻度吸管(1 mL(1 mL、10mL)10mL)研缽或均質(zhì)器恒研缽或均質(zhì)器恒 溫水浴箱溫

2、水浴箱3v生理鹽水生理鹽水(成分：氯化鈉成分：氯化鈉 8.5g)蒸餾水加至蒸餾水加至1000mL,溶解后，分裝到加溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90mL，103.43kPa（121 15 lb）20min高壓高壓滅菌。滅菌。vSCDLP 液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基v成分：酪蛋白胨成分：酪蛋白胨 17g 大豆蛋白胨大豆蛋白胨 3g 氯化鈉氯化鈉 5g 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀 2.5g 葡萄糖葡萄糖 2.5g 卵磷脂卵磷脂 1g 吐溫吐溫80 7g 蒸餾水蒸餾水 1000mLv制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解

3、后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)熱溶解，調(diào)pH為為7.27.3 分裝，分裝，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80 充分混合，冷卻至充分混合，冷卻至25左右使左右使用。用。v注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。v滅菌液體石蠟。滅菌液體石蠟。v 滅菌吐溫滅菌吐溫80。3 3.培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑4 所采集的樣品，應(yīng)具有代表性。所采集的樣品，應(yīng)具有代表性。供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。接到樣品后，應(yīng)

4、立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件

5、下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。品應(yīng)保存一個(gè)月。4 4 樣品的采集及注意事項(xiàng)樣品的采集及注意事項(xiàng)5 液體樣品液體樣品水溶性的液體樣品水溶性的液體樣品，可量取，可量取10mL 加到加到90mL 滅菌生理鹽水中，如樣品少于滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL，仍按，仍按10 倍稀釋法進(jìn)行。如為倍稀釋法進(jìn)行。如為5mL 則加到則加到45mL 滅菌生理鹽水，混滅菌生理鹽水，混勻后，制成勻后，制成1：10 檢液。檢液。油性液體樣品，油性液體樣品，取樣

6、品取樣品10mL，先加，先加5mL 滅菌液體石蠟混勻，再加滅菌液體石蠟混勻，再加10mL 滅滅菌的吐溫菌的吐溫80，在，在4044水浴中振蕩混合水浴中振蕩混合10min，加入滅菌的生理鹽水，加入滅菌的生理鹽水75mL（在（在4044水浴中預(yù)溫），在水浴中預(yù)溫），在4044水浴中乳化，制成水浴中乳化，制成1：10 的懸液。的懸液。5 5 供檢樣品的制備供檢樣品的制備 膏、霜、乳劑半固體狀樣品膏、霜、乳劑半固體狀樣品 親水性的樣品：親水性的樣品：稱取稱取10g，加到裝有玻璃珠及，加到裝有玻璃珠及90mL 滅菌生理鹽水滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min

7、。用其上。用其上清液作為清液作為1:10 的檢液。的檢液。疏水性樣品：疏水性樣品：稱取稱取10g，放到滅菌的研缽中，加，放到滅菌的研缽中，加10mL 滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL 滅菌吐溫滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加，研磨待溶解后，加70mL 滅菌生理鹽滅菌生理鹽水，在水，在4044水浴中充分混合，制成水浴中充分混合，制成1：10 檢檢液。液。6 固體樣品固體樣品稱取稱取10g10g，加到，加到90mL 90mL 滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1

8、1：10 10 的檢液。的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g 10g 樣樣品加入品加入90mL90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min1min2min2min；疏水性；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g 10g 樣品，加樣品，加10mL10mL滅菌液滅菌液體石蠟，體石蠟，10mL 10mL 吐溫吐溫8080，70mL 70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì)滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min3min5min5min。7二、菌落總數(shù)二、菌落總數(shù)1 1 范圍范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范規(guī)定了化妝品

9、中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2 2 定義定義菌落總數(shù)（菌落總數(shù)（Aerobic bacterial count）是指）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH 值、需氧性質(zhì)等），值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含）檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染

10、的程測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。83 3 儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備 三角瓶，三角瓶，250mL。量筒，量筒，200mL。pH 計(jì)或精密計(jì)或精密pH 試紙。試紙。高壓滅菌器。高壓滅菌器。試管：試管：15150mm。滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑9cm。滅菌刻度吸管，滅菌刻度吸管，10mL、1mL。酒精燈。酒精燈。恒溫培養(yǎng)箱：恒溫培養(yǎng)箱：361。放大鏡。放大鏡。9生理鹽水生理鹽水 卵磷脂、吐溫卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 成分：蛋白胨成分：蛋白胨 20g、牛肉膏、牛肉膏 3g、氯化鈉、氯化鈉 5g、

11、瓊脂、瓊脂 15g、卵磷脂卵磷脂1g、吐溫吐溫80 7g、蒸餾水蒸餾水 1000mL 制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫吐溫80，混勻，調(diào)，混勻，調(diào)pH 值值為為7.17.4，加入瓊脂，加入瓊脂，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。0.5氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑成分：成分：TTC 0.5g 蒸餾水蒸餾水 1

12、00mL溶解后過濾，溶解后過濾，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，裝于棕色高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置試劑瓶，置4冰箱備用。冰箱備用。4 4 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑10(1)用滅菌吸管吸取用滅菌吸管吸取1：10 稀釋的稀釋的檢液檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿平皿內(nèi)，每皿1mL。另取。另取1mL 注注入到入到9mL 滅菌生理鹽水試管中滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成換一支吸管，并充分混勻，制成1：100 檢液。吸取檢液。吸取2mL，分別注，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，

13、每皿入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：1000 1:10000，等，每種等，每種稀釋度應(yīng)換稀釋度應(yīng)換1 支吸支吸管。(2)將融化并冷至將融化并冷至4550的卵磷脂吐溫的卵磷脂吐溫80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h。另取一個(gè)。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL 卵磷卵磷脂吐溫脂

14、吐溫80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置，翻轉(zhuǎn)平皿，置361培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h2h，為空白對(duì)照。，為空白對(duì)照。5 5 操作步驟操作步驟(3)為便于區(qū)別化妝品中的為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每顆粒與菌落，可在每100mL 卵磷脂吐溫卵磷脂吐溫80 營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入入1mL0.5的的TTC 溶液，如有細(xì)溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。而化妝品的顆粒顏色無變化。116 6 菌落計(jì)數(shù)方法菌落計(jì)數(shù)方法 先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大用放大

15、 5 倍倍10 倍的放大鏡檢查，以倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。，以代表全皿菌落數(shù)。12 (1)首先選取平均菌落數(shù)在首先選取平均菌落數(shù)在30 個(gè)個(gè)

16、300 個(gè)之間的平皿，作為菌個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表倍數(shù)（見表1 中例中例1）。）。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30 個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1 例例5）。）。7 菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在不在30 個(gè)個(gè)300 個(gè)之間，其中一個(gè)

17、之間，其中一個(gè)稀釋度大于個(gè)稀釋度大于300 個(gè)，而相鄰的另個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于一稀釋度小于30 個(gè)時(shí)，則以接近個(gè)時(shí)，則以接近30 或或300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表倍數(shù)報(bào)告之（見表1 中例中例6）。）。(3)若所有稀釋度的平若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于均菌落數(shù)均大于300 個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以高的平均菌落數(shù)乘以稀釋稀釋 (2)若有兩個(gè)稀釋度，其若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在平均菌落數(shù)均在30 個(gè)個(gè)300 個(gè)之間，個(gè)之間，則應(yīng)求出則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于若其比值小于或等

18、于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2 則報(bào)告其中稀釋度較低則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表的平皿的菌落數(shù)（見表1 中例中例2 及例及例3）。）。13(6)(6)若所有的稀釋度均無菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每若所有的稀釋度均無菌生長(zhǎng)，報(bào)告數(shù)為每g g 或每或每mL mL 小于小于10CFU10CFU。菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10 10 以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100 100 時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可

19、用舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10 10 的指數(shù)來表的指數(shù)來表示（見表示（見表1 1 報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。樣品的稀釋度。14三、糞大腸菌群三、糞大腸菌群1 1 范圍范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗(yàn)。2 2 定義定義糞大腸菌群糞大腸菌群 系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在菌，在44.50.5培養(yǎng)培養(yǎng)24h48h 能發(fā)酵乳

20、糖產(chǎn)酸并能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)氣。該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm。153 3 儀器儀器恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：440.5。溫度計(jì)溫度計(jì) 顯微鏡顯微鏡 載玻片載玻片 接種環(huán)接種環(huán) 電磁爐電磁爐三角瓶，三角瓶，250mL試管：試管：15150mm小倒管小倒管 pH 計(jì)或計(jì)或pH 試紙?jiān)嚰?高壓滅菌器。高壓滅菌器。滅菌吸管，滅菌吸管，10mL、1mL 滅菌平皿：直徑滅菌平皿：直徑90mm4 4 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白

21、胨成分：蛋白胨 40g 豬膽鹽豬膽鹽 10g 乳糖乳糖 10g 0.4溴甲酚紫水溶液溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂卵磷脂 2g 吐溫吐溫80 14g 蒸蒸餾水餾水 1000mL制法：將卵磷脂、吐溫制法：將卵磷脂、吐溫80 溶解到少量蒸餾水中。溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào)到一起混勻，調(diào)pH 到到7.4，加入，加入0.4溴甲酚紫水溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管（每支試管中加一個(gè)小倒管）溶液，混勻，分裝試管（每支試管中加一個(gè)小倒管）。68.95kPa（115 10 lb）20min 滅菌。滅菌。16伊紅美蘭

22、（伊紅美蘭（EMB）瓊脂）瓊脂成分：蛋白胨成分：蛋白胨 10g、乳糖、乳糖 10g、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鉀 2g、瓊脂、瓊脂 20g、2伊紅水伊紅水溶液溶液 20mL、0.5美藍(lán)水溶液美藍(lán)水溶液 13mL、蒸餾水、蒸餾水 1000mL蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用）蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗(yàn)用）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）成分：蛋白胨（或胰蛋白胨）20g、氯化鈉、氯化鈉 5g、蒸餾水、蒸餾水 1000mL 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基成分：蛋白胨成分：蛋白胨 40g 豬膽鹽豬膽鹽 10g 乳糖乳糖 10g 0.4溴甲酚紫水溶液溴甲酚紫水溶液 5mL 卵磷脂卵磷脂 2g 吐溫

23、吐溫80 14g 蒸餾水蒸餾水 1000mL4 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑 革蘭氏碘液革蘭氏碘液成分：碘成分：碘 1g 碘化鉀碘化鉀 2g 蒸餾水加至蒸餾水加至 300mL 革蘭氏染色液革蘭氏染色液 靛基質(zhì)試劑靛基質(zhì)試劑成分：結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫成分：結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 1g 95乙醇乙醇 20mL 1草酸銨水溶液草酸銨水溶液 80mL17 脫色液脫色液：95乙醇。乙醇。復(fù)染液：復(fù)染液：（1）沙黃復(fù)染液）沙黃復(fù)染液：沙黃：沙黃 0.25g、95乙醇乙醇 10mL、蒸餾水蒸餾水 90mL（2）稀石碳酸復(fù)紅液）稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，研細(xì)，加加95乙醇乙醇100mL，

24、放置過夜，濾紙過濾。取該，放置過夜，濾紙過濾。取該液液10mL，加，加5石碳酸水溶液石碳酸水溶液90mL 混合，即為混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液石碳酸復(fù)紅液。再取此液10mL加水加水90mL，即為，即為稀石碳酸復(fù)紅液。稀石碳酸復(fù)紅液。染色法染色法（1）將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染）將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。，水洗。（2）滴加革蘭氏碘液，作用）滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。，水洗。(3)滴加滴加95乙醇脫色，約乙醇脫色，約30s，或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，或?qū)⒁掖嫉螡M整個(gè)涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色再用乙醇滴滿整個(gè)涂片，脫色

25、10s，水洗。，水洗。(4)滴加復(fù)染液，復(fù)染滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。，水洗，待干，鏡檢。(5)染色結(jié)果染色結(jié)果革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用注：如用1:10 稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時(shí)間僅需10s。18(1)取取10mL 1：10 稀釋的檢液，加到稀釋的檢液，加到10mL 雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）雙倍乳糖膽鹽（含中和劑）培養(yǎng)基中，置培養(yǎng)基中，置440.5培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。則報(bào)告為糞大腸菌群陰

26、性。(2)如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置361培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h。同時(shí)取該培養(yǎng)液。同時(shí)取該培養(yǎng)液12 滴接種到蛋白胨水中，滴接種到蛋白胨水中，440.5培養(yǎng)培養(yǎng)24h2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長(zhǎng)。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶齊，表面光滑濕潤(rùn)，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較

27、深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。挑選。(3)挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。(4)在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。陽(yáng)性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。6 6 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基

28、質(zhì)試驗(yàn)陽(yáng)性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。5 操作步驟操作步驟19四、霉菌和酵母菌四、霉菌和酵母菌1 范圍范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中霉菌和酵母菌數(shù)的檢測(cè)方法。本規(guī)范規(guī)定了化妝品中霉菌和酵母菌數(shù)的檢測(cè)方法。本規(guī)范適用于各種化妝品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)。本規(guī)范適用于各種化妝品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)。2 定義定義霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定是指化妝品檢樣在一定條件下霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定是指化妝品檢樣在一定條件下培養(yǎng)后，培養(yǎng)后，1g 或或1mL 化妝品中所污染的活的霉菌化妝品中所污染的活的霉菌和酵母菌數(shù)量，藉以判明化妝品被霉菌和酵母菌和酵母菌數(shù)量，藉以判明化妝品被霉菌和酵母菌污染程度及

29、其一般衛(wèi)生狀況。污染程度及其一般衛(wèi)生狀況。本方法根據(jù)霉菌和酵母菌特有的形態(tài)和培養(yǎng)特性，本方法根據(jù)霉菌和酵母菌特有的形態(tài)和培養(yǎng)特性，在虎紅培養(yǎng)基上，置在虎紅培養(yǎng)基上，置282培養(yǎng)培養(yǎng)72h，計(jì)算所，計(jì)算所生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌數(shù)。生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌數(shù)。20培養(yǎng)箱：培養(yǎng)箱：282。振蕩器。振蕩器。天平。三角瓶，天平。三角瓶，250mL。試管：試管：15150mm。平皿：直徑平皿：直徑9cm。吸管，吸管，1mL、10mL。量筒，量筒，200mL。酒精燈。酒精燈。高壓滅菌器。高壓滅菌器。3 儀器和設(shè)備儀器和設(shè)備21生理鹽水生理鹽水虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基虎紅（孟加拉紅）培養(yǎng)基制法：將上述各成分（除制法：將上

30、述各成分（除虎紅外）加入蒸餾水中溶虎紅外）加入蒸餾水中溶解后，再加入虎紅溶液。解后，再加入虎紅溶液。分裝后，分裝后，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，另高壓滅菌，另用少量乙醇溶解氯霉素，用少量乙醇溶解氯霉素，過濾溶解后加入培養(yǎng)基中，過濾溶解后加入培養(yǎng)基中，若無氯霉素，使用時(shí)每若無氯霉素，使用時(shí)每1000mL 加鏈霉素加鏈霉素30mg。4 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑22(1)樣品稀釋樣品稀釋(2)取取1：10、1：100、1：1000 的檢的檢液各液各1mL 分別注入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)分別注入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度各用稀釋度各用2個(gè)平皿，注入融化并冷至個(gè)平皿，注入融化并冷

31、至451左右的虎紅培養(yǎng)基，充分搖左右的虎紅培養(yǎng)基，充分搖勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置勻。凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置281培養(yǎng)培養(yǎng)72h2h，計(jì)數(shù)平板內(nèi)生長(zhǎng)的霉菌，計(jì)數(shù)平板內(nèi)生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌數(shù)。若有霉菌蔓延生長(zhǎng)，為和酵母菌數(shù)。若有霉菌蔓延生長(zhǎng)，為避免影響其它霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)時(shí)，避免影響其它霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)時(shí)，于于48h2h 應(yīng)及時(shí)將此平板取出計(jì)數(shù)應(yīng)及時(shí)將此平板取出計(jì)數(shù)(4)每每g（或每（或每mL）化妝品含霉）化妝品含霉菌和酵母菌數(shù)以菌和酵母菌數(shù)以CFU/g（mL）表示。表示。(3)計(jì)算方法：先點(diǎn)數(shù)每個(gè)平板上生長(zhǎng)的計(jì)算方法：先點(diǎn)數(shù)每個(gè)平板上生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，求出每個(gè)稀釋度霉菌和酵母菌菌落數(shù)，求出每個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)選取菌的平均菌落數(shù)。判定結(jié)果時(shí)，應(yīng)選取菌落數(shù)在落數(shù)在5 個(gè)個(gè)50 個(gè)范圍之內(nèi)的平皿計(jì)數(shù)，個(gè)范圍之內(nèi)的平皿計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)后，即為每乘以稀釋倍數(shù)后，即為每g（或每（或每mL）檢樣中所含的霉菌和酵母菌數(shù)。其它范檢樣中所含的霉菌和酵母菌數(shù)。其它范圍內(nèi)的菌落數(shù)報(bào)告應(yīng)參照菌落總數(shù)的報(bào)圍內(nèi)的菌落數(shù)報(bào)告應(yīng)參照菌落總數(shù)的報(bào)告方法報(bào)告之。告方法報(bào)告之。5 5 操作步驟操作步驟23謝謝觀賞謝謝觀賞24