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1、1,核酸的分離和純化,2,找答案？,核酸分離純化的原則是什么？為防止核酸降解需要注意什么？核酸制備基本步驟？如何鑒定核酸濃度和純度？核酸的保存方法有哪些？,3,前言,核酸（nucleic acid）是以核苷酸為基本組成單位的生物信息大分子。是遺傳信息的攜帶者，是基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)。,4,核酸的分類(lèi)：DNA 核內(nèi)染色體 DNA。核外也有少量DNA，如線(xiàn)粒體DNA，葉綠體DNA。質(zhì)粒DNA。 RNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。除上述DNA，RNA外，還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。,5,主要內(nèi)容,1. 核酸分離與純化的原則及要求2. 核酸

2、制備的基本步驟3. 核酸的鑒定和保存4. 核酸提取方法簡(jiǎn)介,6,1. 核酸分離與純化的原則及要求,1.1 核酸分離與純化的一般原則(1) 保持核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，是核酸結(jié)構(gòu)和功能研究的最基本要求。 (2) 排除其他分子的污染，保證核酸的純度。,7,1.2 核酸分離與純化的要求(1) 為保證核酸的完整性，（防止降解），在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：盡量簡(jiǎn)化步驟，縮短提取時(shí)間，減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，pH4-10。,化學(xué)因素？生物因素？物理因素？,8,防止核酸的生物降解（細(xì)胞內(nèi)或外的各種核酸酶水解）。 所用器械和一些試劑需高壓滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。操作溫度為0

3、4。DNA酶需要金屬離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等；陰離子表面活性劑SDS。RNA酶分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械180干烤8h。,9,減少物理因素對(duì)核酸的降解，主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的振蕩、突然暴露于低滲液、樣品反復(fù)凍融等。高溫，如長(zhǎng)時(shí)間的煮沸。,10,(2) 核酸純度的要求：非核酸生物大分子的污染降低到最低程度，如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子；排除其它核酸分子的污染，如制備RNA時(shí)，DNA分子是污染物；去除對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)有影響的物質(zhì)，

4、如有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子。,11,2. 核酸制備的基本步驟,12,2.1 破碎細(xì)胞,(1)玻璃勻漿器勻漿,(2)液氮研磨法富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；富含膠原蛋白的皮膚、肌腱；堅(jiān)硬的組織如骨骼。,13,(3)高速組織搗碎機(jī)搗碎(4)超聲波處理法,(5)化學(xué)處理法(SDS、吐溫80等）(6)生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,14,2.2 核酸分離，去除蛋白,核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負(fù)靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開(kāi)，同時(shí)避免核酸降解。,15,（1）加入SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋

5、白質(zhì)上游離出來(lái)的功能；（2） 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；,16,（3）酚/氯仿抽提酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對(duì)核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機(jī)相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時(shí)氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時(shí)，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機(jī)相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醇=25：24：1）。,17,(1）使用注意 酚通常是透明無(wú)色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檠趸锟善茐暮?/p>

6、酸的磷酸二酯鍵。 (2）安全操作 酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重的灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。,使用酚時(shí)應(yīng)注意,18,2.3 沉淀核酸,重新調(diào)整核酸的濃度，起到濃縮核酸的作用； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)；改變核酸的溶解緩沖液。,DNA純化柱,核酸提?。x心柱型）利用硅膠膜特異吸附核酸,19,2.3.1 核酸的有機(jī)溶液沉淀法,當(dāng)核酸溶液的pH值大于4時(shí)，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)。 鉀、鈉、鎂、鋰及銨根等陽(yáng)離子形成的鹽，通過(guò)屏蔽帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)使DNA分子聚結(jié)在一起而不溶于許多有機(jī)溶劑。,20,核酸沉淀的鹽類(lèi)及濃度,21,乙醇優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)鹽類(lèi)沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)： 需要

7、量大，一般要求低溫操作。,常用的有機(jī)沉淀劑,22,異丙醇優(yōu)點(diǎn)： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長(zhǎng)時(shí)間放置。缺點(diǎn)： 易使鹽類(lèi)、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70乙醇漂洗數(shù)次。,23,聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點(diǎn)： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對(duì)分子質(zhì)量的PEG進(jìn)行DNA沉淀時(shí)，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgCl2。,24,精胺,精胺不是有機(jī)溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)

8、凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開(kāi)，達(dá)到純化DNA的目的。,25,2.3.2 核酸沉淀的溫度和時(shí)間,一般強(qiáng)調(diào)，核酸沉淀在低溫長(zhǎng)時(shí)間下進(jìn)行。但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易導(dǎo)致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。,26,3. 核酸的濃度和純度的測(cè)定,3.1 紫外分光光度法鑒定核酸 3.2 熒光光度法鑒定核酸,27,3.1 紫外分光光度法鑒定核酸,3.1.1 紫外分光光度法測(cè)DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無(wú)顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測(cè)定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。,結(jié)論：在波長(zhǎng)260nm紫外光下，1 OD

9、值的吸光度相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50 g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 ug/ml。,28,紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度的操作步驟,a分光光度計(jì)先用一定量的水校正零點(diǎn)。b吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加入到盛有一定體積水的石英比色杯中。,29,c測(cè)定待測(cè)樣品在230nm、260nm和280nm的OD值d計(jì)算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000； RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40/1000。e分析純度。,核酸定量?jī)x可直接獲得濃度，不用計(jì)算。,小分子雜質(zhì),核酸,蛋白質(zhì),30,核酸的紫外吸收光譜,超微量核酸定量

10、儀更加方便,31,A：測(cè)DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280=1.8 （1.71.9） OD260m/OD2302.01) OD260/OD2801.9, RNA污染。2) OD260/OD2801.6，存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD2302.0，溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸等。注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,3.1.2 紫外分光光度法分析純度,32,B：測(cè)RNA 純的RNA樣品OD260OD280=2.0(1.72.0) OD260/OD2302.01）OD260/OD280比值太小，蛋白質(zhì)或酚的污染；2）OD260

11、/OD280 2.0，可能被異硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及鹽存在。,33,3.2 熒光光度法鑒定核酸,3.2.1 測(cè)定核酸含量：原理：DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測(cè)，是估計(jì)水平。,常用的熒光染料還有:golden view, gel red, sybr green,34,3.2.2 熒光光度法鑒定核酸純度原理：溴化乙錠(EB)等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果

12、。,35,核酸鑒定實(shí)際常用操作程序,核酸定量?jī)x測(cè)定濃度，OD260/OD280及OD260/OD230比值。,瓊脂糖電泳，UV下觀察驗(yàn)證純度及判斷是否降解,36,(1) 對(duì)DNA DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 長(zhǎng)期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2) 對(duì)RNA RNA樣品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70 保存; 可以沉淀形式貯于乙醇，可在-20 中長(zhǎng)期保存; 最常用無(wú)Rnase水或高壓后的DEPC水溶解RNA，凍貯于-70-80 。,3.3 核酸的保存,TE：Tris-Cl, EDTA,37,4、核酸提取方法簡(jiǎn)單介紹,4.1 基因組DN

13、A的提取方法4.2 質(zhì)粒的提取和純化4.3 Trizol法提取總RNA,38,4.1 基因組DNA的提取方法,4.1.1 酚抽提法,以含EDTA、SDS及RNase的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用pH8.0的Tris飽和酚抽提。,（DNA）,39,原理：在正常情況下，核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對(duì)有序排列，形成了疏水環(huán)境。在此環(huán)境中，核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。特點(diǎn)： 不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。 快速，簡(jiǎn)捷。,4.1.2 基因組DNA提取試劑盒（離

14、心柱型）,常用的試劑盒：Qiagen,40,離心柱型基因組DNA提取步驟,41,甲酰胺解聚法：細(xì)胞裂解步驟與酚抽提法一致，但以高濃度甲酰胺裂解液裂解DNA與蛋白質(zhì)復(fù)合體，再以透析除去雜質(zhì)玻璃棒纏繞法：將基因組DNA沉淀纏繞于帶鉤玻璃棒上帶出，溶于pH8.0的TE異丙醇沉淀法玻璃珠吸附法,4.1.3 其他的基因組DNA提取方法,42,透析，沉淀，電泳，選擇性沉淀,4.1.4 DNA樣品的進(jìn)一步純化,4.1.5 DNA片段的回收,原則：提高回收率，去除雜質(zhì)污染從瓊脂糖凝膠中回收： DEAE纖維素膜插片電泳法， 電泳洗脫法 冷凍擠壓法從聚丙烯酰胺凝膠中回收：壓碎與浸泡,43,4.2 質(zhì)粒的提取和純化

15、,質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)：超螺旋，半開(kāi)環(huán)，線(xiàn)性DNA理化性質(zhì)：與一般核酸相似，但抗切割和抗變性能力更強(qiáng)所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟： 培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離質(zhì)粒DNA(有時(shí)還要求純化質(zhì)粒DNA，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需)。 選擇哪一種方法主要取決于以下幾個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)要求。,44,4.2.1 質(zhì)粒提取原理,45,4.2.2 質(zhì)粒DNA的純化與回收,純化CsCL-EB法聚乙二醇沉淀法柱層析法回收：與基因組DNA類(lèi)似,46,4.3 RNA的分離和純化,RNA易被RNase水解，RNase除細(xì)胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周?chē)沫h(huán)境中RN

16、ase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定排除RNase的污染是RNA制備成功與否的關(guān)鍵,47,4.3.1 RNA制備的條件與環(huán)境,潔凈的實(shí)驗(yàn)室操作人員帶口罩，勤換手套玻璃器皿（如勻漿器）、鑷子180干烤8 h或更長(zhǎng)時(shí)間槍頭、EP管0.1%DEPC水浸泡過(guò)夜，再高壓；或直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)Rnase的槍頭和EP管冰上勻漿，4 離心,48,Trizol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性。Trizol中還加入了8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。,4.3.2 Trizol法提取總RNA,49,Trizol法提取總RNA步驟,Chloroform,首選Invitrogen,50,Trizol法提取RNA步驟,1、每50-100mg 組織加入1ml Trizol ，用勻漿器勻漿處理 ，室溫放置5min，使其充分裂解。 12,000rpm 離心5min，棄沉淀。2、加入氯仿200微升每管，劇烈振蕩15s ，室溫放置2-3 min 。 12000g ,4 ，離心15