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1、1,核酸的分離純化和鑒定,2,核酸包括DNA、RNA，在細(xì)胞中都與蛋白質(zhì)結(jié)合而存在。 分離純化核酸總的原則 :1、保證一級結(jié)構(gòu)的完整性，完整的一級結(jié)構(gòu)是研究核酸 結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)； 減少化學(xué)、物理、生物因素對核酸的降解： 避免過酸、過堿對磷酸二酯鍵的破壞； 避免機(jī)械剪切力以及高溫煮沸； 抑制DNase或RNase的活性；2、排除蛋白質(zhì)、脂類、糖類等分子的污染。,3,真核DNA提取的主要步驟,真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都可以用來制備基因組DNA。溫和裂解細(xì)胞，溶解DNA，使DNA與組蛋白分離；采用化學(xué)或酶學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子。,4,外周血白細(xì)胞DNA的提?。∟aI法）

2、,原理 利用雙蒸水低滲溶脹紅細(xì)胞及白細(xì)胞膜，釋放出血紅蛋白及細(xì)胞核，NaI破核膜并有效解離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使核酸處于易提取狀態(tài)， 再以氯仿/異戊醇抽提（蛋白質(zhì)變性沉淀并溶解脂類，異戊醇可減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生），離心后DNA存在于上層水相中，以37%異丙醇沉淀及洗滌DNA，即獲得白細(xì)胞DNA。用此法提取的DNA可用于Southern 雜交、PCR的模板等。,5,【試劑】,16 mol/L NaI 2氯仿/異戊醇(24:1 V/V)混合液，應(yīng)在棕色密封瓶中保存。3異丙醇（isopropanol）(A.R)437% 異丙醇或70%乙醇5雙蒸水(ddH2O) (高壓滅菌)6TE緩沖液 (pH

3、 8.0) (10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高壓滅菌。,6,操作步驟,取新鮮抗凝血100l置Ep管中, 離心10000rpm1 min。棄上清，加ddH2O 200l, 搖勻20s。加6mol/L NaI 200l, 緩慢倒置搖勻20s。于管內(nèi)加氯仿/異戊醇(24:1)400l, 緩慢顛倒混勻兩相，離心10 000rpm10min。吸取上層水相350l置一新Ep管中，加純異丙醇200l, 混勻。室溫放置15min, 離心14 000rpm12min。,7,Water phase (DNA),Water phase(DNA),proteins precipit

4、ate,chloroform /isoamyl alcohol (lipids),STEP 5,8,小心棄去上清，再加37%異丙醇（或70%乙醇）1 ml(勿搖動)，離心14000rpm12min.小心棄異丙醇（或乙醇），于室溫敞口放置直至可見的痕量液體揮發(fā)殆盡。加50l TE緩沖液溶解DNA, 以瓊脂糖凝膠電泳鑒定或-20保存。,9,標(biāo)本必須新鮮，提取前細(xì)胞應(yīng)保持完整。所用Ep管、滴頭等用品及ddH2O、試劑等應(yīng)高壓滅菌，操作盡量在4以下進(jìn)行?；靹蛟噭?、吸取上清液等操作時應(yīng)避免動作劇烈。棄去異丙醇時動作應(yīng)輕，切忌甩干，以免DNA丟失。0.54-1倍的異丙醇可選擇性沉淀DNA和大分子rRNA和

5、mRNA，但對5SRNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀。一般不需在低溫條件下長時間放置。其缺點是易使鹽類與DNA共沉淀；在DNA沉淀中的異丙醇難以揮發(fā)除去，所以常規(guī)需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。室溫下放置16h或65放置1h, 可加快基因組DNA沉淀的溶解。,【注意事項】,10,核酸的鑒定與分析,紫外分光光度法可用于確定核酸的濃度及純度。核酸的分級分離。層析技術(shù)及凝膠電泳法，凝膠電泳分離法分制備型和分析型，根據(jù)分離核酸片段的大小可選擇不同參數(shù)或條件的瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳。核酸雜交技術(shù)用于鑒別某個特定的片段。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）對目

6、的基因進(jìn)行DNA序列分析及鑒定 。DNA測序 基因表達(dá)分析（RNA詳細(xì)結(jié)構(gòu)和數(shù)量的分析）,11,DNA的鑒定,一、紫外法測DNA的純度及濃度原理： 組成核酸的嘌呤嘧啶堿基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，這是紫外測定核酸的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。OD值為1時相當(dāng)于大約50g/ml雙鏈DNA 。通過測定A260和A280的比值可估算核酸的純度。紫外法僅用于測定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液。,12,操作,取15l DNA樣品于3ml雙蒸水中，分別于260、280、230nm處比色并記錄。定量分析： DNAA260核酸稀釋倍數(shù)(3000

7、/15)50/1000 =10A260(ug/ul)純度分析： DNA A260/A280=1.8 A260/A2801.8，有RNA雜質(zhì)，用RNase消化； A260/A2801.7,有雜蛋白，重復(fù)抽提純化步驟; A260/A2302.0，可能有鹽未除盡。注：此法不能區(qū)分DNA和RNA，不能用于核酸粗制品的測定。,13,核酸凝膠電泳,核酸是帶均勻負(fù)電荷的分子，在電場中向正極移動，不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由泳動時，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開。以適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持介質(zhì)，具有分子篩效應(yīng)，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離的目的

8、，此為分離、鑒定和純化核酸片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。,14,DNA的瓊脂糖凝膠電泳,原理DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動過程中, 因DNA分子的大小及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。電泳時加溴化乙錠（EB），其與DNA結(jié)合形成一種熒光絡(luò)合物，在254365nm紫外線照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢測DNA。,15,【試劑與材料】,15TBE緩沖液(pH 8.3)：54 g Tris堿, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。 20.5TBE緩沖液 (pH 8

9、.3)3溴化乙錠(EB)： 5 mg/ml412% 瓊脂糖凝膠: 瓊脂糖12 g加至100 ml 0.5TBE緩沖液, 加熱熔解備用。56凝膠上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中，4保存。6DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),16,【操作步驟】,1瓊脂糖凝膠板的制備：將1%2%瓊脂糖凝膠加熱溶化均勻，冷卻到65加EB至終濃度0.5g/ml，倒入凝膠槽，厚度約35mm，放置樣品梳，待冷卻成形后取出梳子及隔板，放入水平電泳槽中，緩沖液淹沒過膠12mm為止。2加樣：樣品中加1/5體積的6凝膠上樣緩沖液，混勻，取15l加入凝膠點樣孔中。同時要設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物。3電泳：電壓

10、210V/cm 膠, 待溴酚藍(lán)移至凝膠的2/3距離時，關(guān)閉電源。4取出凝膠塊，置紫外透射反射分析儀上觀察，即可見桔紅色的DNA區(qū)帶。,17,【注意事項】,1加樣時勿破壞樣品孔，否則DNA帶型不整齊。2上樣緩沖液中適量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加樣品密度，使樣品均勻沉到樣孔底，而溴酚藍(lán)、二甲苯青可使樣品帶色，便于上樣及估計電泳時間和判斷電泳位置。3EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對于含有EB的溶液用后應(yīng)妥善凈化處理。4電泳過程中，EB向陰極移動，延長電泳時間，EB會從凝膠中遷移出來，從而使小片段DNA難于檢測，可將凝膠浸在0.5 g/ml EB溶液中重新染色后檢測。5加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.10.5g即可有良好的觀察效果。6小的凝膠微型和中型凝膠的電泳一般比大凝膠要快，常用于快速分析。小膠通常要在高電壓下電泳(10 V/cm)。應(yīng)注意電泳槽盛裝緩沖液的體積要相對較大。,18,思考題,1、分離核酸的基本原則包括哪兩方面？2、試比較用EB進(jìn)行DNA凝膠電泳前（加在上樣緩 沖液中）、電泳中（加在凝膠中）、電泳后 （凝膠浸泡于EB溶液中）的染色過程，各有 何有優(yōu)缺點？,