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1、I C S 1 1 . 2 2 0e 4 11 .中 華 人 民 共 和 國 農(nóng) 業(yè) 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn)N Y / T 5 7 1 -2 0 0 2馬 腺 疫 診 斷 技 術(shù)D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r s t r a n g l e s2 0 0 2 一 0 8 一 2 7發(fā)布2 0 0 2 門 2 一 0 1實施中 華 人 民 共 和 國 農(nóng) 業(yè) 部發(fā) 布N v / T 5 7 1 - - 2 0 0 2前言 馬腺疫是馬、 騾、 驢的一種急性傳染病， 典型癥狀為發(fā)熱、 上 呼吸道及咽喉鉆膜呈現(xiàn)卡他性炎癥， 領(lǐng)下淋巴結(jié)表現(xiàn)急性化膿性炎

2、癥 農(nóng)業(yè)部( 1 9 9 9 ) 規(guī)定馬 腺疫為二類動物疫病， 本標(biāo)準(zhǔn)采用的 診斷技術(shù)系我州多 年來行 之有效， 且為國際公認(rèn)的方法 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄 本標(biāo)準(zhǔn)山農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口. 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位: 中國人民解放軍軍需大學(xué)。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起 q-人: 工世若、 王興龍、 沈廣、 雷連成。N Y / T 5 7 1 一2 0 0 2馬 腺 疫 診 斷 技 術(shù)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了馬腺疫臨床檢查及病原菌分離培養(yǎng)鑒定的技術(shù)要求，本標(biāo)準(zhǔn)適用于馬屬動物產(chǎn)地、 集散地、 國境口岸、 飼養(yǎng)及使用單位( 含個體) 馬腺疫的診斷及檢疫2 規(guī)范性引用文件 下列文

3、件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。 凡是注日期的引用文件， 其隨后所有的修改單( 不包括勘誤的內(nèi)容) 或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)， 然而， 鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。G B 4 7 8 9 . 2 8 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、 培養(yǎng)基和試劑3 臨床檢查I飛 檢查前準(zhǔn)備 檢查用主要藥械有體溫計、 聽診器、 保定器、 膠手套、 線手套, 3 來蘇兒、 ( ) _ 1 %新潔爾滅等.術(shù)者穿全套工作服， 戴膠手套及線手套; 助手穿工作服3 . 2 檢查方法 由助手保定被檢馬， 術(shù)者按常規(guī)方法做臨床檢查，

4、 重點檢查鼻腔和領(lǐng)下淋巴結(jié)。3 . 3 臨床特征3 . 3 . 1 一過型腺疫 鼻腔貓膜潮紅， 流出漿液性或茹液性鼻液， 領(lǐng)下淋巴結(jié)輕度腫脹。3 . 3 . 2 典型腺疫 體溫3 9 C - - 4 1 C . 鼻腔流出翁性至膿性鼻液， 領(lǐng)下 淋巴結(jié)腫大， 表面凹凸不平， 觸之硬實， 界限清楚， 如雞蛋大甚至拳頭大， 周圍發(fā)生炎癥時， 腫脹加劇， 充滿于整個下領(lǐng)間隙， 界限不清， 熱痛明顯， 以后隨著炎癥的發(fā)展， 局部組織腫脹化膿， 腫脹完全成熟， 自行破潰， 流出大量黃白色茹稠膿汁， 體溫恢復(fù)正常， 隨后， 創(chuàng)內(nèi)肉芽組織新生， 逐漸愈合。病程約2 周一3 周。3 . 3 . 3 惡性型腺痊

5、如果病馬抵抗力很弱， 則馬腺疫鏈球菌可由領(lǐng) 下 淋巴結(jié)的化膿灶轉(zhuǎn)移到其他淋巴結(jié)， 形成化膿灶，甚至轉(zhuǎn)移至肺和腦等器官， 發(fā)生膿腫， 體溫多稽留不降， 常因極度衰弱或繼發(fā)膿毒敗血癥死亡3 . 3 . 4 臨床診斷結(jié)果 根據(jù) 3 . 3 . 1 -3 . 3 . 3 項描述的臨床癥狀， 初步確定患馬是否發(fā)生了馬腺疫及其型別。4 細(xì)菌學(xué)檢查4 . 1 器材 恒溫箱、 高壓蒸汽滅菌器、 顯微鏡、 試管架、 滅菌小試管, 5 ml滅菌注射器、 煮沸消毒器、 外科剪、 棉棒、 鑷子、 載玻片、 鉑金耳、 酒精燈等4 . 2 培養(yǎng)基及實驗動物4 . 2 . 1 培養(yǎng)基: 1 0 %血清肉湯, 5 % - 1

6、 0 %血清瓊脂平板、 5 %綿羊血液瓊脂平板及美藍(lán)牛乳培養(yǎng)基， R eN Y / T 5 7 1 - 2 0 0 2制方法見附錄A ( 規(guī)范性附錄) 。4 . 2 . 2 昆明系小鼠. 體重1 7 g -2 0 g , 清潔級。4 . 3 病料標(biāo)本采集 病馬領(lǐng)下淋巴結(jié)未破潰膿腫以碘酒及酒精消毒后， 用注射器吸取膿汁泣人火菌小試管中; 已破潰的膿腫， 以滅菌生理鹽水浸濕的棉棒蘸取膿汁或鼻腔分泌液放于滅菌小試管 I , 立即檢查， 或放4 C冰箱中保存待檢。4 . 4 直接鏡檢4 . 4 . 飛 操作方法 將病料標(biāo)本涂于載玻片L 、 于 燥、 固定按G B 4 7 8 9 . 2 8 - . 1

7、 9 9 4 中2z 條規(guī)定進行革蘭氏染色。4 . 4 . 2 結(jié)果觀察 馬腺疫鏈球菌的形態(tài)及染色特征是: 在膿球間散布著山幾個甚至 _ 白個球菌組成的波浪狀彎曲的長 鏈條， 各菌大小不等， 多呈扁球狀， 直徑約1 h e m. 菌體著色不均， 革吮氏陽性4 . 5 分離培養(yǎng)4 . 5 . 1 操作方法 用鉑金耳釣取病料， 接種于 1 0 %血清肉湯( 見第A . 1 章) 做增菌培養(yǎng)， 接種于5 寫- - 1 0 %血清瓊脂平板( 見第 A . 2 章) 及 5 %綿羊血液瓊脂平板( 見第 A . 3 章) 做分離培養(yǎng) 十 3 7 C 恒溫箱中孵育 2 4 h -7 2 h4 . 5 . 2

8、 結(jié)果觀察 觀察到下述結(jié)果， 符合馬腺疫鏈球菌培養(yǎng)特征 a ) 1 0 環(huán)血清肉湯: 培養(yǎng)后。 生成長 鏈條狀， 2 4 h肉湯輕度混濁. 4 8 h 后長成長 鏈條狀的菌體纏繞 t 起， 呈棉絮狀沉于試管底， 7 2 h以后上清液清朗 h ) 5 ,00 - 1 0 %血清瓊脂: 形成圓形、 透明、 閃光、 中央微隆起、 表面光滑的露珠樣小菌落。強毒株的 菌落表而常呈顆粒狀結(jié)構(gòu). 用放大鏡觀察更為明顯。 c ) 5 %綿羊血液瓊脂: 發(fā)生月型溶血， 即在露珠狀小菌落周圍形成界限分明、 完全透明的溶血帶， 該帶的寬度可達(dá) 2 mm-3 m m以上。4 . 6 生物化學(xué)特性4 . 6 . 1 操

9、作方法 選可疑菌落， 接種于G B 4 7 8 9 . 2 8 -1 9 9 4中3 . 2 條規(guī)定的糖發(fā)醉管和“ B t 7 8 9 . 2 8 1 9 9 4中3 . 9 以及G 1 3 4 7 8 9 . 2 8 - - - 1 9 9 4中3 . 1 7中規(guī)定的生化培養(yǎng)基， 于3 7 C孵育 7 2 h4 . 6 . 2 結(jié)果觀察 分別于孵育的第 2 4 h , 4 8 h及7 2 h觀察記錄結(jié)果符合以下特性 確定為馬腺疫鏈球菌: 。 ) 糖發(fā)酵試驗: 發(fā)酵葡萄糖、 麥芽糖、 蔗糖、 甘露糖、 單奶糖、 楊廿等， 產(chǎn)酸不產(chǎn)氣: 不發(fā)酵覃糖、 山 梨醇、 甘露醇、 乳糖。 b ) 生化試

10、驗: 不分解馬尿酸鈉， 不還原硝酸鹽， 不還原美藍(lán)牛乳( 見第 A . 4 章) ， 在膽汁中不被溶 解 4 . 了 小鼠感染試驗4 . 7 . 1 操作方法 用滅菌柱射器吸取 1 0 %血清肉湯0 . 1 m l , -0 . 2 m l - 或以滅菌的I , H為7 . 磷酸鹽緩沖液( P I S S ) 稀釋成 : 2 - - 3 的膿汁。 . 3 m工 一。 . 5 m工 ， 分別注于3只小鼠( 見4 . 2 . 2 ) 皮下， 觀察 3 卜 5 d ,4 . 7 . 2 觀察結(jié)果 I )刊加有 1 0 %血清肉湯 N h培養(yǎng)物 1 . 8 . 1試管中加人火菌的斗 一 膽汁 。_ m

11、l . . 混勻， 置 3 7 C 恒溫箱中作用 1 5。 、 ， 培養(yǎng)物仍混濁， 說明被檢細(xì)菌不被膽汁溶解， 否則培養(yǎng)物透明N Y / T 5 7 1 -2 0 0 2 小鼠在2 4h -3 c h發(fā)生敗血癥或膿毒敗血癥死亡。 剖檢時 在腹腔液、 心血、 肝、 脾等中檢出呈短鏈條或雙球菌狀鏈球菌 可確定為有毒力的馬腺疫鏈球菌。4 . 8 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 根據(jù)4 . 4 -4 . 7 項的檢查結(jié)果， 確定病料標(biāo)本中是否有有毒力的馬腺疫鏈球菌。5 綜合判定幼駒體溫升高( 3 9 C-4 1 C) . 領(lǐng)下淋巴結(jié)腫大， 隨著炎癥的發(fā)展. 腫脹的淋巴結(jié)化膿破潰。采取膿汁。 分離出鏈球菌， 該菌不發(fā)酵

12、草糖、 山梨醇、 甘露醇和乳糖. 即可診斷為馬腺疫6 鑒別診斷6 . 1 馬傳染性貧血病 惡性型腺疫患畜， 體溫呈稽留熱、 貧血、 黃疽， 用抗生素及解熱藥治療效果不佳， 易與馬傳染性貧血病混淆 但有典型的腺疫病史， 白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增多馬傳染性貧血病病馬的粘膜可能有出血點， 心臟機能紊亂， 白細(xì)胞數(shù)接近正?；蚵詼p少， 馬傳染性貧血抗體檢測陽性。6 . 2 馬異疽 領(lǐng) 卜 淋巴結(jié)硬固腫脹. 無熱痛， 不化膿， 往往不能移動， 且鼻疽有特征性的鼻疽結(jié)節(jié)和潰瘍， 或放射狀疤痕鼻疽菌素點眼試驗呈陽性反應(yīng)。N Y / P 5 7 1一 2 0 0 2 附錄A( 規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基的配制A.

13、 1A. 21 0%血清肉湯成分 :普通營養(yǎng)肉湯1 0 0 ML健康馬( 兔) 血清1 0 ML制法: 將血清無菌加人裝有普通營養(yǎng)肉湯的中試管中， 混勻。5%一1 0%血清瓊脂平板成分:普通營養(yǎng)瓊脂健康馬( 兔) 血清制法 : 將普通瓊脂加熱熔化1 0 0 m l5 m l _ - 1 0 m l， 冷至 5 3 C左右， 無菌加人血清， 棍勻后. 傾人平皿， 制成平板。A . 3A. Q5%綿羊血液瓊脂平板成分:普通營養(yǎng)瓊脂脫纖維綿羊( 馬、 兔) 血液制法 : 將普通瓊脂加熱熔化1 0 0 mlsn i l -冷至 5 3 C左右， 無菌加入血液， 混勻后， 傾人平皿， 制成平板。美藍(lán)牛乳培養(yǎng)基 成分: 脫脂牛乳1 0 0 ML 1 %美藍(lán)水溶液5 ml , 制法: 往脫脂后的牛乳中加人 1 %美藍(lán)水溶液， 混勻， 分裝于小試管中， 以5 5 k P a高壓蒸汽滅菌2 0 mi n,