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1、第二十章 經(jīng)典液相色譜法,經(jīng)典液相色譜法,經(jīng)典液相色譜法包括經(jīng)典柱色譜法和平面色譜法。經(jīng)典色譜法與現(xiàn)代色譜法的區(qū)別主要在于輸送流動相方式、固定相種類和規(guī)格、分離效能、分析速度和檢測靈敏度等方面?，F(xiàn)代色譜法靈敏度高，分離效率高。但經(jīng)典色譜法也有許多優(yōu)點(diǎn)，設(shè)備簡單，操作方便，分析速度快。,第一節(jié) 吸附色譜法,一、基本原理(一)吸附與吸附平衡 吸附是吸附劑、溶質(zhì)、溶劑分子三者之間的復(fù)雜相互作用。 吸附平衡常數(shù)K 不同的溶質(zhì)有不同的K值，一個(gè)組分的色譜特性完全由吸附平衡常數(shù)K決定。,第一節(jié) 吸附色譜法,K值大說明該物質(zhì)被吸附得牢，在固定相中停留時(shí)間長，在柱中移動速度慢； 要使混合物中各個(gè)組分實(shí)現(xiàn)相互分

2、離，則它們的K值相差必須足夠大，且K值相差越大，各組分越容易彼此分離。,第一節(jié) 吸附色譜法,(二)吸附等溫線 吸咐等溫線是指在一定溫度下，某一組分在固定相和流動相之間達(dá)到平衡時(shí)，以組分在固定相中的濃度Cs為縱坐標(biāo)，以組分在流動相中的濃度Cm為橫坐標(biāo)得到的曲線。 等溫線的形狀是重要的色譜特性之一，它有三種類型：線型、凸型和凹型。 通常在低濃度時(shí)，每種等溫線均呈線型，而高濃度時(shí)，等溫線則呈凸型或凹型。,第一節(jié) 吸附色譜法,1線型吸附等溫線 是理想的等溫線 當(dāng)吸附平衡常數(shù)K一定時(shí)，其吸附等溫線為線型，即達(dá)到平衡時(shí)，組分在固定相中的濃度Cs與其在流動相中濃度Cm成正比，直線的斜率為K。,第一節(jié) 吸附色

3、譜法,2非線型吸附等溫線 在幾乎所有的實(shí)際情況下，吸附等溫線都有些彎曲而呈非線型。一般液-固吸附色譜系統(tǒng)大多呈現(xiàn)凸形吸附等溫線。,第一節(jié) 吸附色譜法,A. 線型 B. 凸型 C.凹型 a. 吸附等溫線 b. 相應(yīng)的洗脫峰型,第一節(jié) 吸附色譜法,二、吸附劑吸附色譜法對吸附劑有下面幾點(diǎn)基本要求： 有較大的表面積，有足夠的吸附能力，但對不同物質(zhì)其吸附能力又不一樣； 與洗脫劑、溶劑及樣品不起化學(xué)反應(yīng)，并在所用溶劑和洗脫劑中不溶解； 粒度均勻，粒度要細(xì)。,第一節(jié) 吸附色譜法,(一)常用的吸附劑 吸附劑可分為有機(jī)和無機(jī)兩大類。其中以硅膠和氧化鋁、聚酰胺較為常用。 1.硅膠 2. 氧化鋁,第一節(jié) 吸附色譜法

4、,1.硅膠 其骨架表面的硅醇基，能吸附大量水分，這種表面吸附水稱為“結(jié)合水”，加熱至105110左右能除去，除去的水分越多，吸附能力越強(qiáng)。 硅膠的活性與含水量有關(guān)，“結(jié)合水”高達(dá)17%以上時(shí)，吸附能力降低。,第一節(jié) 吸附色譜法,硅醇基有兩種形式，一種是游離羥基()，另一種是鍵合羥基()，當(dāng)硅膠加熱到200以上時(shí)，失去水分，使表面羥基變?yōu)楣杳呀Y(jié)構(gòu)()，后者為非極性，不再對極性化合物有選擇性保留作用而失去色譜活性。 () () () 由于硅膠具有弱酸性，所以選擇性地保留胺類和其它堿性化合物。,第一節(jié) 吸附色譜法,2. 氧化鋁 色譜用氧化鋁有堿性、中性和酸性三種。 堿性氧化鋁(pH910)適用于堿性

5、和中性化合物的分離。 中性氧化鋁(pH7.5)適用范圍廣，凡是酸性、堿性氧化鋁可以使用的，中性氧化鋁也都適用。 酸性氧化鋁(pH54)適用于分離酸性化合物。,第一節(jié) 吸附色譜法,(二)吸附劑的活性 吸附劑的活性和含水量有一定的關(guān)系。含水量愈高，其吸附活性愈低，活性級數(shù)愈大，吸附力就愈弱。反之亦然，含水量愈低，其活性愈高，活性級數(shù)愈小，吸附力就愈強(qiáng)。 吸附劑使用前必須先經(jīng)過活化處理。在一定溫度下，加熱除去水分以增強(qiáng)活性的過程稱之為活化。反之，加入一定量水分便可使其活性降低，亦稱為失活或減活。 分離極性小的物質(zhì)，一般選用吸附活性大的吸附劑，反之，分離極性大的物質(zhì)則應(yīng)選用活性小的吸附劑。,第一節(jié) 吸

6、附色譜法,三、色譜條件的選擇 選擇色譜分離條件時(shí)，必須從吸附劑、被分離物質(zhì)、流動相（展開劑）三方面綜合考慮。 組分 吸附劑 流動相 極性 活性小 極性 非(弱)極性 活性大 非極性或弱極性,第一節(jié) 吸附色譜法,四、操作方法(一)柱色譜1. 色譜柱的制備(1)玻璃柱 干裝法 濕裝法 (2) 尼龍柱 用于色譜分離的尼龍柱，應(yīng)具備下列條件：應(yīng)有一定的強(qiáng)度，且易于切割；對有機(jī)溶劑呈惰性，且能用手工熱封；能透過紫外線，便于將無色物質(zhì)在柱上定位。,第一節(jié) 吸附色譜法,2. 加樣與洗脫 首先將被分離樣品溶于一定體積的溶劑中，選用的溶劑極性應(yīng)低，體積要小。 上樣前，應(yīng)將柱上端的溶劑放出至近吸附劑表面。沿管壁加

7、入樣品溶液，溶液加完后，打開活塞使液體慢慢放出。 在洗脫時(shí)，用分液漏斗連續(xù)不斷地加入洗脫劑，并保持一定高度的液面。在收集洗脫液時(shí)，應(yīng)采用等份集。3檢出 可以通過分段收集流出液，采用相應(yīng)的物理和化學(xué)方法進(jìn)行檢出。常用的檢出方法很多，如化學(xué)反應(yīng)法、TLC及其它方法。,第一節(jié) 吸附色譜法,(二)薄層色譜 按薄板的分離效能，可分為經(jīng)典薄層色譜法(TLC)及高效薄層色譜法(HPTLC)兩類。 薄層色譜有下列一些特點(diǎn)： (1)展開時(shí)間短，一般只需十幾分鐘到幾十分鐘； (2)分離能力較強(qiáng)，一塊板可分離多達(dá)約20個(gè)組分； (3)靈敏度高，通常使用的樣品量為幾至幾十微克； (4)顯色方便，可直接噴灑腐蝕性的顯色

8、劑； (5)所用儀器簡單，操作方便； (6)既能分離大量樣品，也能分離微量樣品。,第一節(jié) 吸附色譜法,1薄層板的制備（1）手工制板 手工制板所用的玻璃板，除另有規(guī)定外，一般為10cm10cm,10cm15cm,20cm10cm或20cm20cm的2mm厚規(guī)格，要求板面平整，洗凈后放置在薄層板放置架上備用。然后用手動或自動涂布器將已調(diào)好的固定相均勻地涂鋪在玻璃板上。最好用自動涂布器。,第一節(jié) 吸附色譜法,制備含粘合劑的硬板，要先制備固定相的勻漿，調(diào)制固定相的勻漿時(shí)可將一定量的固定相按上表比例加入適量水或粘合劑，在研缽中或在勻漿器中調(diào)勻，倒入手動或自動涂布器中涂布。室溫下陰干后，活化后備用。 定性

9、定量分析時(shí)薄層厚度為0.30.5mm，制備薄層厚度為0.52mm。（2）預(yù)制板 預(yù)制板是由工廠生產(chǎn)出來的商品板，使用方便，涂布均勻，薄層光滑，牢固結(jié)實(shí)，分離效果及重現(xiàn)性好。品種繁多，規(guī)格齊全，能滿足不同的分析要求。,第一節(jié) 吸附色譜法,2點(diǎn)樣點(diǎn)樣體積：經(jīng)典薄層一般為110L，高效薄層為 100500nL； 點(diǎn)樣形狀：一般為圓形點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.0 1.5cm，樣點(diǎn)直徑為23mm，高效薄層原點(diǎn)直徑 約為1mm，要盡可能避免多次點(diǎn)樣；點(diǎn)間距離：可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況而定。一般經(jīng)典薄層為 12cm，高效薄層為0.5cm；常用的點(diǎn)樣器具：定量毛細(xì)管（0.5、1、2、3、4、5和 10L）和鉑銥合金毛細(xì)管

10、（100nL和200nL），另 一類是注射器式的可變體積 微量點(diǎn)樣器和毫微點(diǎn)樣 器，用手工點(diǎn)樣時(shí)常用定量毛細(xì)管。,第一節(jié) 吸附色譜法,薄層點(diǎn)樣示意圖 S-對照品溶液； 1.2-樣品溶液；原點(diǎn)； d1-點(diǎn)間距離； d2-原點(diǎn)與板底邊距離；d3-展距；F-溶劑前沿,第一節(jié) 吸附色譜法,3展開 點(diǎn)樣后的薄層，置密閉的玻璃槽中，用合適的展開劑展開。展開劑浸入薄層下端高度不應(yīng)超過0.5cm。點(diǎn)樣處不可接觸展開劑，展距一般為815cm。 對于樣品成分復(fù)雜的混合物，可采用雙向展開法。,第一節(jié) 吸附色譜法,點(diǎn)于同一薄層的同一物質(zhì)的斑點(diǎn)，在色譜展開過程中，靠薄層邊緣處斑點(diǎn)的Rf值與中心區(qū)域斑點(diǎn)的Rf值有所不同，

11、此稱邊緣效應(yīng)。,第一節(jié) 吸附色譜法,為了減少邊緣效應(yīng)，可采取下列辦法：(1)最好用較小體積的展開缸或?qū)⒈釉诟變?nèi)放置一定時(shí)間，待溶劑蒸汽達(dá)到飽和后再行展開；(2)在展開缸內(nèi)壁貼上浸濕展開劑的濾紙條；(3)如采用3cm以下的狹小薄板，只點(diǎn)23個(gè)點(diǎn)。,第一節(jié) 吸附色譜法,4斑點(diǎn)的檢出（1）光學(xué)檢出法化合物本身有色，在自然光下可直接觀察斑點(diǎn)。有些化合物在可見光下不顯色，但可吸收紫外光，且能發(fā)射更長波長的光而顯示不同顏色的熒光斑點(diǎn)，故在紫外燈下顯現(xiàn)不同顏色。紫外分析儀有短波型(254nm)和長波型(366nm)兩種燈。在可見紫外光下都不顯色，也沒有合適顯色方法的化合物，可以用熒光薄層進(jìn)行分離?；衔镌?/p>

12、紫外光燈下可在發(fā)亮的背景上顯示暗斑。,第一節(jié) 吸附色譜法,（2）試劑顯色法噴霧顯色 將顯色劑用電動薄層噴霧器直接噴灑于硬 板上，根據(jù)顯色劑的不同，可直接顯色或加熱顯色。浸漬顯色 也可用浸漬法處理薄層，使生成顏色穩(wěn) 定、輪廓清楚、靈敏度高的色斑。利用某些物質(zhì)的蒸 氣與樣品作用生成不同顏色或產(chǎn)生熒光，也可用于斑 點(diǎn)的檢出。蒸氣檢出法 多數(shù)有機(jī)化合物能吸附碘蒸氣而顯示黃 色斑點(diǎn)。有些化合物遇碘蒸氣后發(fā)生紫外吸收的變化 或產(chǎn)生極強(qiáng)的熒光。,第一節(jié) 吸附色譜法,五、定性與定量分析(一)定性分析1.比移值Rf 在薄層色譜法中，常用比移值Rf來表示各組分在色譜中的位置。 Rf,Rf與分配系數(shù)K及容量因子k之

13、間的關(guān)系為： Rf Rf值為常數(shù)，其值在01之間。 Rf =0，表示化合物在薄層上不隨溶劑的擴(kuò)散而移動，仍在原點(diǎn)位置； Rf =1，表示溶質(zhì)不進(jìn)入固定相，即表示溶質(zhì)和溶劑同步移動。 一般要求Rf值在0.20.8之間。,第一節(jié) 吸附色譜法,影響Rf值最重要的因素是吸附劑的性質(zhì)與展開劑的極性和溶解能力。 當(dāng)應(yīng)用同一種吸附劑和同一種展開系統(tǒng)時(shí)，被測物質(zhì)的Rf值又受下列因素的影響： 1薄層厚度 2展開距離 3展開容器中展開劑蒸氣的飽和度 4點(diǎn)樣量 5薄層含水量,第一節(jié) 吸附色譜法,2.相對比移值Rst 為了解決由于Rf值重現(xiàn)性差，進(jìn)行定性困難的問題，常采用相對比移值Rst來定性。 相對比移值Rst的定

14、義為： Rst值是相對Rf值，是樣品與參考物移動距離之比，可消除許多系統(tǒng)誤差。參考物是另外加入也可以直接以樣品中某一組分作為參考物。 Rst值可以大于1。,第一節(jié) 吸附色譜法,（二）定量分析1間接定量法 (洗脫測定法) 薄層展開后，將被測物斑點(diǎn)或區(qū)帶捕集，用溶劑洗脫，然后再用適當(dāng)?shù)姆治龇椒?比色法、分光光度法、氣相色譜、熒光分析法等)測定含量。,2薄層掃描法 該法快速、簡便，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確，適用于多組分物質(zhì)和微量組分的定量。（1）薄層掃描儀 薄層掃描儀光學(xué) 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖,第一節(jié) 吸附色譜法,測定方式及原理A 吸收測定法 可見區(qū)(370700 nm)用鎢燈，紫外區(qū)(200370nm)用氘燈為光

15、源。 B 反射測定法 光束照到薄層斑點(diǎn)上測量，反射光強(qiáng)度。 C 透射測定法 光束照到薄層斑點(diǎn)上，測量透射光強(qiáng)度。 D 熒光測定法 用汞燈或氙燈(200700 nm)為光源。,吸收參數(shù)（KX）與樣品濃度成正比，所以無論是反射法還是透射法，測得值與樣品之間都不呈線性。 透射法測定時(shí)，SX值越大，吸光度越大；反射法測定時(shí)，SX值越大，反射度越小。 SX值取決于薄層吸附劑的性能、粒度和分布情況。SX值要預(yù)先測定，通過儀器的線性補(bǔ)償器，用電路系統(tǒng)將彎曲的曲線校正為直線后用于定量。 線形校正 1-校正前的標(biāo)準(zhǔn)曲線 2-校正后的標(biāo)準(zhǔn)曲線,第一節(jié) 吸附色譜法,掃描方式 掃描方式分線性(直線)掃描和鋸齒(曲折)

16、掃描法。 鋸齒形掃描方式能消除展開后斑點(diǎn)形狀不規(guī)則而引起的誤差，可獲得滿意的定量結(jié)果。雙波長法掃描 光源的光分兩路，通過兩個(gè)分光器出來兩束不同波長的光。一路用于測量樣品，稱樣品波長S；另一路做為對照，稱參比波長R。 雙波長法可以消除斑點(diǎn)處薄層本身的干擾，消除薄層厚度不均勻引起的基線波動，能可靠地檢測痕量組分.,第一節(jié) 吸附色譜法,（2）定量方法外標(biāo)法 分為外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法。A 外標(biāo)一點(diǎn)法 工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量，需點(diǎn)一種濃度的對照品溶液。 CF1A C為樣品的濃度或重量，A為樣品的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù),B 外標(biāo)二點(diǎn)法 工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少要點(diǎn)在同一薄層板上二種不同濃度的對照品溶液(或一種濃度兩種點(diǎn)樣量) 。F1 和F2都是通過測量隨行的對照品溶液的濃度（C1和C2）和峰面積（A1和A2）求出，所以這種方法又叫隨行標(biāo)準(zhǔn)法。,第一節(jié) 吸附色譜法,內(nèi)標(biāo)法 本法與外標(biāo)法的主要區(qū)別，在于用內(nèi)標(biāo)法時(shí)面積累計(jì)值為被測樣品和內(nèi)際物的面積之比。由于內(nèi)標(biāo)物與被測物的測定是在同通道上，因此要求內(nèi)標(biāo)物的吸收波長接近被測物質(zhì)的吸收波長，并