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1、1,Chap. 5 經典液相色譜法,2,本章內容層次,掌握：吸附色譜法、分配色譜法的基本原理以及應用，薄層色譜法的基本操作。熟悉：離子交換色譜法的基本原理以及應用。了解：尺寸排阻色譜法、聚酰胺色譜法的基本原理以及應用。,3,1 吸附色譜法,1. 基本原理1.1 定義 一種溶質基于吸附現象而獲得分離的液固色譜分析方法，按操作方式又可分為吸附柱色譜和薄層色譜。,4,1.2 吸附色譜法的依據吸附過程的兩個規(guī)律：1）吸附過程是可逆的，存在著吸附 解附的動態(tài)平衡,存在一個吸附平衡常數 K=Cs/Cm2）吸附劑對不同物質的吸附行為有差異,5,吸附機理 流動相通過固定相時，吸附劑表面的活性中心吸附流動相分子

2、，當組分分子進入柱子時，會趕走流動相分子而占據吸附劑的活性中心位，即組分被吸附；反之，溶劑分子也可把溶質分子趕走，即解吸。,6,1.3 吸附等溫線 指在一定溫度下，某一組分在固定相和流動相之間達到平衡時，組分在固定相中的濃度Cs對組分在流動相中的濃度Cm作圖得到的曲線，用函數描述為Cs=f（Cm），它描述了組分在兩相中濃度之間的關系。,7,等溫線的形狀是重要的色譜特性之一。它反映了一定溫度下，吸附劑對溶液中某一組分的吸附能力。對某一體系，組分的分布取決于吸附等溫線，它有三種類型：線型、凸型和凹型。通常在低濃度時，每種等溫線均呈線型，而在高濃度時，等溫線則呈凸型或凹型。,8,9,2. 吸附劑,2

3、.1 對吸附劑的要求1）顆粒要有一定的細度且粒度要均勻2）具有較大的吸附表面積和一定的吸附能力3）與洗脫劑、樣品不起化學反應，且不溶于洗脫劑中,10,2.2 常用吸附劑無機類：氧化鋁、硅膠、硫酸鈣、滑石粉、硅藻土等。有機類：活性炭、淀粉、蔗糖等。其中以硅膠和氧化鋁較為常用。,11,1）氧化鋁優(yōu)點：分離能力強、活性可控分類：酸性、中性、堿性 以中性氧化鋁使用較多,用來分離生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定的苷類、醌、內酯等化合物?；罨瘻囟龋?00400,12,2）硅膠優(yōu)點：適用于各類樣品的分離吸附能力：取決于骨架表面的硅醇基吸附機理：硅膠表面羥基作為質子給予體，通過氫鍵形式將溶質

4、吸附在硅膠表面。由于硅膠具有弱酸性，所以選擇性地保留胺類和其它堿性化合物?；罨瘻囟龋?05110,13,2.3 吸附劑的活性吸附劑的活性與含水量有一定的關系。吸附劑在使用前必須先經過活化處理?；罨涸谝欢囟认?，加熱除去水分以增強活性的過程。,14,15,3. 色譜條件的選擇,在吸附色譜中，除了正確選擇吸附劑外，還可以通過流動相的選擇來改變K值，或改變一對化合物的K值比，從而使它們的K值有最大的差別而達到分離。流動相在色譜分析中除了起著溶質通過色譜柱的作用，還影響著溶質的分配系數，所以在色譜分析中流動相的選擇也很重要。極性較大的化合物可以比較強的從溶液中被吸附劑吸附，需要極性較大的洗脫劑才能洗

5、脫下來。,16,選擇色譜分離條件時，必須從吸附劑、被分離物質、流動相三方面綜合考慮。,17,4. 操作方法薄層色譜,4.1 基本概念 1）薄層色譜法 將吸附劑（或載體）均勻地鋪在玻璃板或塑料板、鋁箔、聚酯薄膜上，形成薄層，把要分離的樣品點加在薄層上，然后用合適的溶劑展開而達到分離、鑒定和定量的目的。,18,2）比移值Rf 在薄層色譜法中，常用比移值Rf來表示各組分在色譜中的保留行為。 Rf(A)= b/c Rf(B)=a/c,19,在給定條件下，Rf值為常數，其值在01之間。 當Rf值為0時，表示化合物在薄層上不隨溶劑的擴散而移動，仍在原點位置；Rf為1時，表示溶質不進入固定相，即表示溶質和溶

6、劑同步移動。Rf值：一般要求0.2 0.8 最佳范圍0.30.5。,20,3）薄層色譜法的特點展開時間短，一般只需十幾到幾十分鐘；分離能力強，斑點集中；靈敏度高，通常用量為幾至幾十微克；顯色方便；儀器簡單，操作方便。,21,4.2 操作技術薄層色譜法的操作步驟：選擇制板點樣展開斑點的檢出定性定量,22,1）選 擇(1)選板 玻璃板表面光滑、平整清潔(2)固定相：吸附劑；粘合劑(3)流動相(4)顯色劑,23,2）制板 薄層板的制備，就是將吸附劑均勻地涂鋪在玻璃板上，使成薄層稱之為制板。制板的步驟：(1)吸附劑的涂布 (2)板的活化,24,(1) 吸附劑的涂布常用薄板：加粘合劑的硬板和不加粘合劑的

7、軟板一般氧化鋁采用軟板多，而硅膠常采用硬板。硬板的涂鋪方法：傾注法 、平鋪法、涂鋪器 、噴霧法,25,(2) 板的活化 鋪成的薄層，必需置于水平臺面上晾干（也可以熱風吹干），再置烘箱中活化即可。,26,3）點樣 薄層分析時，一般使用微量注射器或毛細管點樣。注意事項：（1）溶劑應易揮發(fā)或用流動相。（2）樣品濃度合適，一般對照品濃度宜控制在幾mg/ml。,27,（3）點樣體積宜在20ml以下，點加量一般為幾幾十微克，直徑以小于3mm為宜。少量多次點加。（4）點樣時，原點距離底邊、兩側邊以及點與點之間的距離均應在11.5cm。（5）要求原點直徑一致，點樣間距精確。所有原點應在同一水平線上，斑點面積也

8、盡可能一致。,28,（6）用于定量或分離提純時，往往沿著起始線點加樣品成一條狀，以使點加的量相應增多。（7）點樣時最好在密閉容器中或比較干燥的條件下完成，避免薄板吸收水分降低活性，若在空氣中點樣，時間最好在10分鐘內完成。點樣完畢后使溶劑揮干，再選用適當溶劑展開。,29,4）展開（1）展開原理 將薄板一端浸入展開劑，點樣處不可接觸展開劑，展開劑借助毛細作用上升，帶動樣品中組分的遷移。,30,（2）展開箱的分類常規(guī)飽和箱（NS）用溶劑飽和的濾紙作襯里使展開箱充分飽和（CS）夾心板箱，可減少展開箱的體積 （3）展開劑的選擇首選單元溶劑，再選混合溶劑（由簡至繁）,31,（4）邊緣效應 定義：點于同一

9、薄層的同一物質的斑點，在色譜展開過程中，靠薄層邊緣處斑點的Rf值與中心區(qū)域斑點的Rf值有所不同，此種現象稱為邊緣效應。產生原因：邊緣效應多數出現在極性強弱不等的混合溶劑展開系統(tǒng)中，用單一組分展開劑，邊緣效應較為少見。,32,減少邊緣效應的辦法 最好用較小體積的展開缸或將薄層在缸內放置一定時間，待溶劑蒸汽達到飽和后再展開；如在展開缸內壁貼上浸濕展開劑的濾紙條，效果也很好；如采用3cm以下的狹小薄板，只點23個點時，也會減小邊緣效應。,33,5）斑點的檢出（1）光學檢出法（2）顯色劑法顯色劑種類：專屬型顯色劑、通用型顯色劑,34,6）定性與定量分析定性分析（1）用保留值定性Rf（2）用多種溶劑系統(tǒng)

10、定性 定量分析（1）斑點捕集后洗脫測定法（2）薄層掃描法,35,影響Rf值的因素：分離對象的化學結構、固定相的組成及性質、流動相的組成及性質、介質的影響（包括實驗室及展開箱的濕度、溫度、飽和與否、上樣量等等）解決方法：為了解決由于Rf值重現性差，進行定性困難的問題，也可以采用相對比移植Rst來定性。 Rst Rf (i)/Rf(s),36,薄層掃描法,定義：直接測量板上被分離化合物斑點的吸收、反射、熒光等進行定量的方法。分類：吸收掃描法和熒光掃描法掃描方式：線性掃描法和鋸齒掃描法定量方法：外標法外標一點法和外標兩點法 內標法,37,優(yōu)點：快速、高效、靈敏主要不同：吸附劑顆粒小 薄層厚度薄 點樣

11、直徑小 展開方式不同,高效薄層色譜,38,2 分配色譜法,分配色譜是將某種溶劑涂布在固體顆粒表面或紙纖維上形成一層液膜作為固定相，利用各組分在固定相和流動相之間分配系數的不同而實現分離的方法。,39,1. 基本原理,分配定律：分配色譜以直線型等溫線最普遍，洗脫峰峰形對稱而尖銳。 在分配色譜中，用溶劑極性來描述分配作用的，因此溶解度的“相似相溶”經驗規(guī)則可用于分配色譜中。,40,2. 分配色譜的分類,正相色譜：固定相的極性大于流動相的極性 保留：極性越大的組分保留越強反相色譜：流動相的極性大于固定相的極性 保留：極性越小的組分保留越強,41,3. 載體,作用：負載固定液要求：化學惰性，粒度小而均

12、勻，純凈，與固定液間有較大的分子間作用力。常用載體：硅膠 、硅藻土 、纖維素,42,4. 固定液相與流動液相,溶劑對選擇原則1）不相互溶（預先互飽和）2）Ss Sm ( 提高分析效率),43,固定相與流動相的選擇,先采用對各組分溶解度均較大的溶劑為洗脫劑 根據分離情況改變洗脫劑的組成和比例（即在流動相中加入一些別的溶劑），調整各組分的分離及洗脫速率,44,5. 操作方法,5.1 柱色譜 固定相的涂布與裝柱 分配柱色譜的加樣和洗脫5.2 紙色譜 色譜紙的選擇和處理 點樣及展開分離混合物，Rf值之差最好大于0.05以免斑點重疊；鑒別單一化合物，Rf值最好在0.40.6之間。,45,6. 應用,分配

13、色譜適用于各種類型化合物的分離，尤其適用于是強極性親水性物質的分離（如：脂肪酸和多元醇）優(yōu)點：較好的重現性，并可根據K值預示分離結果。分配系數在較大的濃度范圍內是常數，其洗脫峰多數為對稱峰，峰形尖銳。在大多數情況下，均能找到一組合適的溶劑進行分離。,46,吸附色譜法:親脂性物質分配色譜法:親水性物質,47,3 離子交換色譜法,以離子交換樹脂為固定相，用水或與水混合的溶劑作為流動相，利用離子交換樹脂對各組分離子交換能力（親合力）的不同而使實現分離的方法稱為離子交換色譜法(ion exchange chromatography, IEC)。,48,1. 離子交換樹脂的分類,離子交換樹脂主要由高分子

14、聚合物的骨架和活性基團所組成，它的骨架具有特殊的網狀結構。以聚苯乙烯型最常用。根據所交換離子的電荷可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂 。,49,1.1 陽離子交換樹脂,根據可交換的離子的不同氫型樹脂含有SO3H,COOH,OH,SH,PO3H2等酸性基團鹽型樹脂含有鈉鹽、鉀鹽依據其酸性強度強酸型陽離子交換劑弱酸型陽離子交換劑樹脂的酸性強度一般按下列次序遞減：RSO3HHO-R- SO3HRPO3H2RCOOHROH,50,磺化苯乙烯樹脂,由苯乙烯和二乙烯苯經聚合，磺化而成，是應用最普遍的離子交換樹脂,51,交換反應：,R-SO3-H+ + Na+ + Cl- R-SO3- Na+ + H+

15、+ Cl-,52,1.2 陰離子交換樹脂,根據可交換的離子的不同氫氧型樹脂N+R3OH- 氯型樹脂N+R3Cl- 依據其堿性強度強堿性陰離子交換樹脂 弱堿性陰離子交換樹脂,53,2. 離子交換樹脂的特性,2.1 交聯度定義：表示離子交換樹脂中交聯劑的含量，通常以重量百分比來表示。 高交聯度樹脂網狀結構緊密，網眼小，剛性較強，能承受一定的壓力；孔穴較多；溶脹較小，吸水量少。低交聯度樹脂網狀結構疏松，網眼大，具有較好的滲透性，但存在著易變形和耐壓差等缺點。,54,根據分離對象選擇樹脂交聯度：,分離小分子物質（氨基酸） 選擇8%樹脂為宜分離分子量較大的物質（多肽） 選擇24%樹脂為宜,55,2.2

16、交換容量定義是指每克干樹脂中真正參加交換反應的基團數。常用單位為mmol/g。交換容量是一個重要的實驗參數，通常以實測值為準。,56,2.3 溶脹定義當將樹脂浸入水中后，有大量水進入樹脂內部，引起樹脂膨脹的現象稱為溶脹。溶脹的程度取決于交聯度的高低 交聯度高，溶脹??；交聯度低，溶脹大。一般說來，lg樹脂最大吸水量為lg。,57,2.4 粒度 離子交換樹脂的顆粒大小，一般是以溶脹狀態(tài)所能通過的篩孔來表示。實際操作根據需要選用不同粒度的樹脂： 交換純水常用1050目樹脂，分析用樹脂常用100200目。,58,3. 離子交換平衡,離子交換反應可用下式表示：R-A+ + B+ R-B+ + A+ ,59,離子交換反應平衡時 ：,選擇性系數 （交換系數）R-A+R-B+分別表示在樹脂相中A+、B+ 的離子濃度A+、B+分別表示A+、B+離子在溶液中的濃度。,60,當各離子強度和樹脂的填充狀況一定時，KA/B為常數。KA/B1，說明樹脂對B比對A有更大的親合力離子的相對親合力將隨水合離子半徑的增加和電荷的減小而降低。,61,離子交換色譜的分離機理,利用樣品組分選擇性系數的不同而進行分離主要用于金屬