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1、食品微生物檢驗(yàn)方法,中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限有限責(zé)任公司何艷玲,內(nèi)容提要,菌落總數(shù)檢測(cè)大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè)金黃色葡萄球菌檢測(cè)沙門氏菌檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè),菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)的概念,菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。,菌落總數(shù)測(cè)定衛(wèi)生學(xué)意義,判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。及時(shí)反映食品加工過(guò)程是否符合 衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評(píng) 價(jià)提供依據(jù)。通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多， 則可考慮致病菌污染的可能性越 大，菌落總數(shù)的多少在一定程度 上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。

2、,FDA BAM 菌落總數(shù)測(cè)定流程,檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇23個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行） 每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） 35 ，48 2h菌落計(jì)數(shù),FDA BAM 菌落計(jì)數(shù)方法,選擇25250CFU之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下： N=C/（1*n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報(bào)告EAPC/ml（g）為25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)250CFU，但不足100/cm2 ，報(bào)告EAPC/ml（g）為最

3、接近250CFU的平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。所有平板的菌落數(shù)都超過(guò)100/cm2 ，計(jì)算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計(jì)最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml（g）為65*100* 1/d。無(wú)法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA（Laboratory Accident）。最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。,ISO4833-2003 菌落總數(shù)測(cè)定流程,檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液） 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇23個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行） 每皿內(nèi)加入

4、適量（1215mL）平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）， 301 ，72 3 h菌落計(jì)數(shù),如果懷疑樣品中含有在培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)的菌落，待瓊脂凝固后，在其上覆蓋一層（4mL）水瓊脂。,平板疊放不超過(guò)6個(gè),ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法,選擇連續(xù)2個(gè)稀釋度不超過(guò)300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下： N=C/（n1+0.1*n2）*d所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m 固體樣品： NE=md-1無(wú)菌生長(zhǎng)：液體樣品：less than 1; 固體樣品：less than 1 d-1最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。,菌落總數(shù)測(cè)定幾

5、點(diǎn)說(shuō)明,由于檢樣中采用30/35有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營(yíng)養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來(lái)。鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來(lái)源于細(xì)胞塊，也可以來(lái)源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報(bào)告。,菌落總數(shù)測(cè)定幾點(diǎn)要求,每個(gè)樣品從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過(guò)15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到

6、平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長(zhǎng)時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長(zhǎng)。檢樣過(guò)程中應(yīng)用稀釋劑做空白對(duì)照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過(guò)程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開(kāi)一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過(guò)程中有無(wú)受到來(lái)自空氣的污染。檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4 放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對(duì)照。,大腸菌群的定義,大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與

7、糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過(guò)人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。,大腸桿菌的定義,大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為+-或-+-的細(xì)菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附

8、性大腸桿菌（EAEC）。,大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系,耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37 培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）,衛(wèi)生學(xué)意義,大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HAC

9、CP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37，在42-44 條件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46 。,在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3中菌

10、落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。,大腸菌群及大腸桿菌測(cè)定 MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM）,檢樣50g+450ml稀釋液 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒(méi)有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ，48 2h 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報(bào)告

11、結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）,大腸菌群測(cè)定MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明,MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)： 1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所

12、用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentations）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。 2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)

13、?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還小），有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。,不適于用大腸菌群作為糞便污染指示菌的食品,冷凍食品經(jīng)射線照射處理的食品 pH較高的食品 在上述食品中大腸菌群的細(xì)菌比許多腸道病原微生物更易死亡。,大腸桿菌測(cè)定EMB選擇性分離鑒別,EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無(wú)綠色金屬光澤,大腸桿菌測(cè)定EMB選擇

14、性分離鑒別,EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見(jiàn)光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。,大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色,基本原理： 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌兩大類。 革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少

15、。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。,大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色,Gram negative,Gram positive,Gram straining,大腸桿菌測(cè)定革蘭氏染色,基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加

16、番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。,大腸桿菌測(cè)定生化鑒定,I M Vi C生化試驗(yàn),金黃色葡萄球菌生物學(xué)特性,金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8m左右，排列成葡萄串狀 ，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。,革蘭氏染色陽(yáng)性，但衰老、死亡或被白細(xì)胞吞噬的菌體，常呈革蘭氏陰性。,金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)特性,金黃色葡萄球菌在肉湯中呈渾濁生長(zhǎng)，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈渾濁生長(zhǎng)。,血平板上金黃色葡萄球菌呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。,Baird-Parker平板上金黃色葡萄球菌圓形突起、光滑、濕潤(rùn)，顏色呈灰色到黑色，邊緣淡色，周圍為一渾濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度。,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法適用性,MPN法：適用于檢測(cè)帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品。增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。,定量方法,定性方法,金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)直接平板計(jì)數(shù)法,檢樣（5