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1、食品微生物檢驗(yàn)方法（FDA與ISO對(duì)比）內(nèi)容提要：l 菌落總數(shù)檢測l 大腸菌群及大腸桿菌檢測l 金黃色葡萄球菌檢測l 沙門氏菌檢測l 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測 菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)的概念l 菌落總數(shù)是指在被檢樣品的單位重量（g）、容積（ml）或表面積（cm2）內(nèi)，所含能于某種固體培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)后所生成的菌落的總數(shù)。菌落總數(shù)測定衛(wèi)生學(xué)意義l 判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量。l 及時(shí)反映食品加工過程是否符合衛(wèi)生要求，為被檢食品衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。l 通常認(rèn)為，食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則可考慮致病菌污染的可能性越大，菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。 FDA BAM

2、菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇23個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） 35 48 2h菌落計(jì)數(shù)FDA BAM 菌落計(jì)數(shù)方法l 選擇25250CFU之間的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下： N=C/（1*n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落數(shù)都不足25CFU，報(bào)告EAPC/ml（g）為25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate countl 所有平板的菌落數(shù)都超過250CFU，但不足100/cm2 ，報(bào)告EAPC/ml（g）為最接近250CFU的

3、平板菌落數(shù)的估計(jì)值，乘以相應(yīng)的稀釋度。l 所有平板的菌落數(shù)都超過100/cm2 ，計(jì)算平板的面積（直徑為90mm的平板面積為65cm2），估計(jì)最高稀釋度每cm2的菌落數(shù)，乘以相應(yīng)平板面積作為該稀釋度的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，報(bào)告EAPC/ml（g）為65*100* 1/d。l 無法計(jì)數(shù)的平板報(bào)告LA（Laboratory Accident）。l 最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。按照4舍6入，5是奇進(jìn)偶不進(jìn)。ISO4833-2003 菌落總數(shù)測定流程檢樣xg/mL+9xml稀釋液（磷酸鹽緩沖液）適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇23個(gè)連續(xù)適宜稀釋度各取1mL分別加入滅菌平皿內(nèi)（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平行）每皿內(nèi)加入適量（1215

4、mL）平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）， 301 ，72 3 h菌落計(jì)數(shù)ISO4833-2003菌落計(jì)數(shù)方法l 選擇連續(xù)2個(gè)稀釋度不超過300CFU的平板，且一個(gè)平板至少含15CFU進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算公式如下： N=C/（n1+0.1*n2）*dl 所有平板的菌落數(shù)都不足15CFU，計(jì)算2平板菌落的算術(shù)平均值m，液體樣品：NE=m 固體樣品： NE=md-1l 無菌生長：液體樣品：less than 1; 固體樣品：less than 1 d-1l 最終結(jié)果保留前兩位有效數(shù)字。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)說明l 由于檢樣中采用30/35有氧條件下培養(yǎng)，因而并不是樣品中實(shí)際的總活菌數(shù)，一些特殊營養(yǎng)要求的細(xì)菌、厭氧菌、微需

5、氧菌、以及非嗜中溫細(xì)菌，均難以反映出來。l 鑒于食品檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個(gè)、成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個(gè)細(xì)胞，因而平板上所得菌落的數(shù)字不應(yīng)報(bào)告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容積或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位（colony forming units，CFU）報(bào)告。菌落總數(shù)測定幾點(diǎn)要求l 每個(gè)樣品從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用的時(shí)間不得超過15min，主要為防止細(xì)菌增殖和產(chǎn)生片狀菌落。樣液與瓊脂應(yīng)充分混合，避免將混合物濺到平皿壁和皿蓋上。皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長時(shí)間放置，然后倒置培養(yǎng)，可避免菌落蔓延生長。l 檢樣過程中應(yīng)用稀釋劑做空白

6、對(duì)照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時(shí)，檢樣過程中應(yīng)在工作臺(tái)上打開一塊空白平板計(jì)數(shù)瓊脂，其暴露時(shí)間應(yīng)與檢樣時(shí)間相當(dāng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。l 檢樣稀釋液有時(shí)帶有食品顆粒，為避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與平板計(jì)數(shù)瓊脂混合的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，于4 放置，以便在計(jì)數(shù)檢樣時(shí)用作對(duì)照。大腸菌群的定義l 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。l 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求，提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完

7、全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸桿菌的定義l 大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。l 大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為+-或-+-的細(xì)菌。l 與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。衛(wèi)生學(xué)意義l 大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品

8、中的糞便污染指標(biāo)。l 食品中檢出大腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。l 大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來，有些國家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有

9、周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。培養(yǎng)特性：l 大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。大腸菌群及大腸桿菌測定 MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM）檢樣50g+450ml稀釋液適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35 ，24 2h 48 2h 沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種

10、BGLB肉湯管 接種EC肉湯 44.50.5 （水浴培養(yǎng)） 24 2h 48 2h 查MPN表報(bào)告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35、1824h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌） 大腸菌群測定MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說明l MPN檢索表： MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。l 初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)： 1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 2

11、）初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。l 產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還小），有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。 大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別EMB平

12、板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無綠色金屬光澤大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別l EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長；l 高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；l 大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；l 該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。大腸桿菌測定革蘭氏染色基本步驟：l 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；l 滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；l 滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水

13、洗；l 滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。l 結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。大腸桿菌測定生化鑒定（表略）金黃色葡萄球菌概述l 根據(jù)伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)，按葡萄球菌的生理化學(xué)組成，將葡萄球菌分為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多為致病性菌，表葡偶爾致病。l 金黃色葡萄球菌是人類化膿性感染中最常見的病原菌?？梢鹁植炕撔愿腥?，如癤、癰、皮下膿腫、外科切口及燒傷創(chuàng)面的感染；也可引起肺炎、偽膜性腸炎、腎盂腎炎、心包炎等多系統(tǒng)的化膿性感染；還可引起敗血癥、膿毒癥等全身性感染。葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。 金黃色葡萄球菌生物學(xué)特性金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.8m左右，排列成葡萄串狀 ，無芽孢，無莢膜。金黃色葡萄球菌