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1、基因工程操作步驟,知識回顧：,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用,載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。,才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。,一、目的基因的獲取,原核細胞的基因結(jié)構(gòu),非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結(jié)合位點,啟動子,終止子,不編碼蛋白質(zhì)。,：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),

2、調(diào)控遺傳信息表達,上 游有RNA聚合酶結(jié)合位點:,基因結(jié)構(gòu),真核細胞的基因結(jié)構(gòu),編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),內(nèi)含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列,：有調(diào)控作用,上游有RNA聚合 酶結(jié)合位點(啟動子)。,與RNA聚合酶結(jié)合位點,基因結(jié)構(gòu),1. 從基因文庫中獲取目的基因,1. 基因文庫的概念:,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。,2. 基因文庫的種類:,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDN

3、A文庫,基因組DNA文庫與cDNA文庫,某生物體內(nèi)全部DNA,許多DNA片段,受體菌群體,與運載體連接導入,基因組文庫,cDNA,受體菌群體,與運載體連接導入,cDNA文庫,某種生物某個時期的mRNA,真核細胞的cDNA的獲取,編碼區(qū),非編碼區(qū),非編碼區(qū),DNA聚合酶,剪接有關(guān)的酶,RNA聚合酶,mRNA前體,mRNA,單鏈DNA,cDNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,轉(zhuǎn)錄,剪接,逆轉(zhuǎn)錄,復(fù)制,啟動子,終止子,基因,不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,小,大,無,有,無,有,某種生物的部分基因,某種生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的

4、基因,根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。,2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因,多聚酶鏈式反應(yīng),體外,特定DNA片段,PCR技術(shù)的操作過程,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加_倍,一,變性,1.目的基因DNA受熱變性，解

5、鏈；2.引物與單鏈互補結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。,過程：,PCR技術(shù)的操作過程,PCR反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增,PCR技術(shù)擴增與DNA復(fù)制的比較,堿基互補配對原則,堿基互補配對原則,四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP,四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化解旋,半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制,半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制,體外復(fù)制,主要在細胞核內(nèi),大量的DNA片段,形成整個DNA分子,熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等,PCR技術(shù)擴增過程,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成_

6、,b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補 的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,3. 人工合成法,在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成,蛋白質(zhì)的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化學合成,推測,推測,思考：化學法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動子和終止子嗎？,人工合成法（真核生物）,反轉(zhuǎn)錄法,目的基因的信使RNA,目的基因,化學合成法,肽鏈氨基酸序列,信使RNA序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推測,推測,單鏈DN

7、A,合成,課堂小結(jié),目的基因的獲取,1、從基因文庫中獲取,2、利用PCR技術(shù)擴增,3、人工合成,種類,基因組文庫：含有一種生物的全部基因,部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因， 如：cDNA文庫,二、基因表達載體的構(gòu)建 基因工程的核心,二、基因表達載體的構(gòu)建核心,（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_。（2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。,（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個重組 DNA分子（重組質(zhì)粒）,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,1.過程:,基因表達載體的構(gòu)建核心,質(zhì)粒,DNA分子,一個切口兩個黏性

8、末端,兩個切口獲得目的基因,DNA 連接酶,重組DNA分子（重組質(zhì)粒）,同一種 限制酶,目的基因與運載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。,表達載體,過程:,基因表達載體的構(gòu)建基因工程的核心,1、目的：,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,2、基因表達載體的組成：,復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因,它們各自的作用是什么?,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標記

9、基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,3.基因表達載體的組成：,它們有什么作用？,a、目的基因,b、啟動子,c、終止子,d、標記基因,位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點,位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄,檢測目的基因是否導入受體細胞,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植 物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。,原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,三、目的基因?qū)胧荏w細胞,構(gòu)建基因表達載體,轉(zhuǎn)入,農(nóng)桿菌,植物細胞,導入,穩(wěn)定維持和表達,過

10、程：,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細胞,操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力 ，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。, 鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um 。,適用：單子葉植物,1、目的基因?qū)胫参锛毎姆椒?（3）花粉管通道法：將目的基因?qū)胫参锛毎?操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞, 特點:十分簡便經(jīng)濟。,例：轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,2、將目的基因?qū)雱游锛毎?方法：顯微注射法,程序,目的基因表達載體提純 取

11、卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,3、將目的基因?qū)胛⑸锛毎?微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞過程：,Ca2+處理大腸桿菌,感受態(tài) 細胞,感受態(tài)細胞 吸收DNA,表達載體與感受態(tài)細胞混合,小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細胞,四、目的基因的檢測與鑒定,導入過程完成后，全部受體細胞都能攝 入重組DNA分子嗎？,1,真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。,2,目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？,不一定，需要檢測,1、鑒定分子水平的鑒定,轉(zhuǎn)基因生物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測轉(zhuǎn)

12、基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,基因探針：,放射性同位素等標記的DNA分子,方法,DNA分子雜交技術(shù),變性,變性,1、鑒定分子水平的鑒定,變性,方法,分子雜交技術(shù),（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉(zhuǎn)基因生物的mRNA,14N,14N,1、鑒定分子水平的鑒定,提取,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi),從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質(zhì),出現(xiàn)雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),2、鑒定個體水平的鑒定,抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝

13、入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。,目的基因的檢測與鑒定,檢測,導入檢測：目的基因是否導入受體細胞,方法,DNA分子雜交,表達檢測,轉(zhuǎn)錄檢測分子雜交,翻譯檢測抗原抗體雜交,分子檢測法,鑒定,抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等,個體水平的鑒定,目的基因的表達和檢測,課堂練習,1、有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來 B、限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運載體導入受體細胞 D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,課堂練習,2、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因與運載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細胞 D、目的基因的檢測和表達,C,【拓展深化】只有第三步將目的基因?qū)胧荏w細胞不需堿基互補配對，其余三個步驟都涉及堿基互補配對,