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1、1.2 基因工程的基本操作程序1知識(shí)回顧：基因工程基本操作的四個(gè)步步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。2一、目的基因的獲取1 1目的基因主要是目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因編碼蛋白質(zhì)的基因：如：與生物抗性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、與工業(yè)用

2、酶相關(guān)的基因、具調(diào)控作用的因子等。2 2獲取目的獲取目的基因基因的常用方法：的常用方法：1 1、從基因文庫(kù)中獲取、從基因文庫(kù)中獲取2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增3 3、人工合成、人工合成3原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì),連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)調(diào)控遺傳信息表達(dá),上 游有RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn):基因結(jié)構(gòu)4真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子 外顯子 啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有RNA聚

3、合 酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)。與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)51.從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。2.基因文庫(kù)的種類:基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)6基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)某生物體內(nèi)全部DNA 許多DNA片段受體菌群體限制酶限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)cDNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入cDNA文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNA7真核細(xì)胞的cDNA的獲取編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶

4、剪接有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子8基因組DNA文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的比較 文庫(kù)類型文庫(kù)類型 cDNA文庫(kù)文庫(kù) 基因組文庫(kù)基因組文庫(kù) 文庫(kù)大小文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的動(dòng)作用的DNA片段）片段）基因中內(nèi)含子基因中內(nèi)含子(位于編碼位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）片段）基因多少基因多少 物種間的基因交流物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因 某種生物的全部基因可以部分基因可以9怎樣從基因文庫(kù)中找到我們所需要的目的基因 根據(jù)目的

5、基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來(lái)獲取目的基因。102.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1 1概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_(kāi)，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。2 2原理：原理：DNADNA復(fù)制復(fù)制原料：原料：模板模板DNADNA；DNADNA引物；四種脫氧核苷引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定酸；熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段3 3前提：前提：已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列11PCR技術(shù)的操作過(guò)程a、D

6、NA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_b、退火（復(fù)性55-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的_。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復(fù)a.b.c步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加_倍一125 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物13過(guò)程：14PCR技術(shù)的操作過(guò)程PCRP

7、CR反應(yīng)體系中目的基因成反應(yīng)體系中目的基因成指數(shù)指數(shù)(2(2n n)形式擴(kuò)增形式擴(kuò)增15PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較DNA復(fù)制復(fù)制PCR技術(shù)技術(shù)場(chǎng)所場(chǎng)所原理原理?xiàng)l件條件解旋方式解旋方式酶酶特點(diǎn)特點(diǎn)結(jié)果結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)原則堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋變復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制體外復(fù)制主要在細(xì)胞核內(nèi)大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等16PCR技術(shù)擴(kuò)增過(guò)程a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板 在熱作用下，斷裂，形成_

8、b、復(fù)性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部_。c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的_。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈173.人工合成法 在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學(xué)合成推測(cè)推測(cè)思考：化學(xué)法合成的目的基因含內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子嗎？18人工合成法（真核生物）反轉(zhuǎn)錄法目的基因的信使RNA目的基因化學(xué)合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測(cè)推測(cè)單鏈DNA合成19課堂小結(jié)目的基因的獲取1、從基因文庫(kù)中獲

9、取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成種類基因組文庫(kù)：含有一種生物的全部基因部分基因文庫(kù)：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫(kù)20二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心1 1目的：目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2 2基因基因表達(dá)載體表達(dá)載體的組成：的組成：復(fù)制原點(diǎn)復(fù)制原點(diǎn)+目的基因目的基因+啟動(dòng)子啟動(dòng)子+終止子終止子+標(biāo)記基因標(biāo)記基因21二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建核心（1）用一定的_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出_。（2）用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處，再加入適量_，形成了一個(gè)重組

10、 DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過(guò)程:2210/19/2022可編輯修改24基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心 1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。252、基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們各自的作用是什么?26啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基

11、因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)273.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,是mRNA結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞28 三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1 1轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。2 2常用的受體細(xì)胞：常用的受體細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。和動(dòng)植物細(xì)胞等。3 3目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。291、目的

12、基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植 物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。30三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞構(gòu)建基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌植物細(xì)胞導(dǎo)入穩(wěn)定維持和表達(dá)過(guò)程：311、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（2）基因槍法：目的基因?qū)雴巫尤~植物細(xì)胞 操作方法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.64um。適用：?jiǎn)巫尤~植物321、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法（3）花粉管通道法：將

13、目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞 特點(diǎn):十分簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)。例：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉332、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法程序目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物343、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少常用菌：大腸桿菌常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細(xì)胞過(guò)程：CaCa2+2+處理處理大腸桿菌大腸桿菌感受態(tài)感受態(tài) 細(xì)胞細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 吸收吸收DNADNA表達(dá)載體表達(dá)載體與感受態(tài)與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞混合3

14、5小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類生物種類植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)顯微注射技術(shù)CaCa2+2+處理法處理法受體細(xì)胞受體細(xì)胞體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵受精卵原核細(xì)胞原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入到將目的基因插入到TiTi質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNAT-DNA上上農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌導(dǎo)入植導(dǎo)入植物細(xì)胞物細(xì)胞整合到受整合到受體細(xì)胞的體細(xì)胞的DNADNA表表達(dá)達(dá)將含有目的基因?qū)⒑心康幕虻谋磉_(dá)載體提純的表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩┤÷眩ㄊ芫眩╋@微注射顯微注射受受精卵發(fā)育精卵發(fā)育獲得獲得具有新性狀的動(dòng)具有新性狀的動(dòng)物物CaCa2+2

15、+處理細(xì)胞處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)體與感受態(tài)細(xì)胞混合胞混合感受感受態(tài)細(xì)胞吸收態(tài)細(xì)胞吸收DNADNA分子分子36 四、目的基因的檢測(cè)與鑒定導(dǎo)入過(guò)程完成后，全部受體細(xì)胞都能攝 入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組真正能攝入重組DNADNA分子的受體細(xì)胞很少。分子的受體細(xì)胞很少。2目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達(dá)？不一定，需要檢測(cè)不一定，需要檢測(cè)371、鑒定分子水平的鑒定轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15NN15NN14NN14NN（1）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子方法 DNA分子雜交技術(shù)變性變性變

16、性變性381、鑒定分子水平的鑒定變性變性方法 分子雜交技術(shù)（2）檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15NN15NN轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14NN14NN391、鑒定分子水平的鑒定提?。?）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法抗原-抗體雜交蘇云金桿菌蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì) 出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)402、鑒定個(gè)體水平的鑒定抗蟲(chóng)、抗病接種實(shí)驗(yàn)，活性比較實(shí)驗(yàn)例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。41目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)導(dǎo)入檢測(cè)：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法DNA分子雜交表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄檢測(cè)分子雜交翻譯檢測(cè)抗原抗體雜交分子檢測(cè)法鑒定抗蟲(chóng)鑒定抗病鑒定活性鑒定等個(gè)體水平的鑒定42類類型型步驟步驟 檢測(cè)內(nèi)容檢測(cè)內(nèi)容方法方法結(jié)果顯示結(jié)果顯示分分子子檢檢測(cè)測(cè)第一第一步步目的基因是否進(jìn)目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞入受體細(xì)胞DNADNA分子雜交分子雜交（DNADNA和和DNADNA之間）之間）是否成功顯示是否成功顯示出雜交帶出雜交帶第二第二步步目