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1、青霉素生產(chǎn)工藝過程青霉素生產(chǎn)工藝過程 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998青霉素生產(chǎn)工藝過程一、青霉素的發(fā)酵工藝過程1、工藝流程（1）絲狀菌三級發(fā)酵工藝流程冷凍管（25，孢子培養(yǎng)，7天）斜面母瓶（25，孢子培養(yǎng)，7天）大米孢子（26，種子培養(yǎng)56h,1:）一級種子培養(yǎng)液（27，種子培養(yǎng)，24h,1:）二級種子培養(yǎng)液（2726,發(fā)酵,7天,1:）發(fā)酵液。（2）球狀菌二級發(fā)酵工藝流程冷凍管（25，孢子培養(yǎng)，68天）親米（25，孢子培養(yǎng)，810天）生產(chǎn)米（28，孢子培養(yǎng)，5660h,1:）種子培養(yǎng)液（2625-24，發(fā)酵，7天，1：）發(fā)酵液。2、工

2、藝控制（1）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，常常因為前期基質(zhì)量濃度過高，對生物合成酶系產(chǎn)生阻遏（或抑制）或?qū)z生長產(chǎn)生抑制（如葡萄糖和錢的阻遏或抑制，苯乙酸的生長抑制），而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長和產(chǎn)物合成，為了避免這一現(xiàn)象，在青霉素發(fā)酵中通常采用補料分批操作法，即對容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加，因為即使是超出最適濃度范圍較小的波動，都將引起嚴重的阻遏或限制，使生物合成速度減慢或停止。目前,糖濃度的檢測尚難在線進行, 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制,而是間接根據(jù)pH 值、溶氧或C02釋放率予以調(diào)節(jié)。（2）

3、溫度：青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差別，但一般認為應(yīng)在25左右。溫度過高將明顯降低發(fā)酵產(chǎn)率，同時增加葡萄糖的維持消耗，降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對菌絲生長和青霉素合成來說，最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過程在菌絲生長階段采用較高的溫度，以縮短生長時間, 到達生產(chǎn)階段后便適當降低溫度，以利于青霉素的合成。（3）pH值：青霉素發(fā)酵的最適pH值一般認為在左右,有時也可以略高或略低一些，但應(yīng)盡量避免pH值超過, 因為青霉素在堿性條件下不穩(wěn)定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中, pH值的變化是葡萄糖流加速度高低的反映。過高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積

4、累使pH值降低；過低的加糖速率不足以中和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起pH值上升。（4）溶氧：對于好氧的青霉素發(fā)酵來說，溶氧濃度是影響發(fā)酵過程的一個重要因素。當溶氧濃度降到30%飽和度以下時, 青霉素產(chǎn)率急劇下降, 低于10%飽和度時, 則造成不可逆的損害。溶氧濃度過高，說明菌絲生長不良或加糖率過低，造成呼吸強度下降, 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個動態(tài)平衡點, 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個參考指標。（5）菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超過臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶

5、氧水平上達到平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強度(取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強度越高)，發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強的發(fā)酵罐及黏度低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。（6）菌絲生長速度：用恒化器進行的發(fā)酵試驗證明，在葡萄糖限制生長的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長速率之間呈一定關(guān)系。當比生長速率低于時，比生產(chǎn)速率與比生長速率成正比, 當比生長速率高于時, 比生產(chǎn)速率與比生長速率無關(guān)。因此，要在發(fā)酵過程中達到并維持最大比生產(chǎn)速率, 必須使比生長速率不低。這一比生長速

6、率稱為臨界比生長速率。對于分批補料發(fā)酵的生產(chǎn)階段來說, 維持的臨界比生長速率意味著每46h就要使菌絲濃度或發(fā)酵液體積加倍, 這在實際工業(yè)生產(chǎn)中是很難實現(xiàn)的。事實上，青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能達到很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補料分批發(fā)酵過程不斷有部分菌絲自溶, 抵消了一部分生長, 故雖然表觀比生長速率低, 但真比生長速率卻要高一些。（7）菌絲形態(tài)：在長期的菌株改良中，青霉素產(chǎn)生菌在沉沒培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長和結(jié)球生長兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸, 故一般比生產(chǎn)速率較高；后者則由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使

7、氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而允許更多的菌絲生長 (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。在絲狀菌發(fā)酵中，控制菌絲形態(tài)使其保持適當?shù)姆种Ш烷L度, 并避免結(jié)球，是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當大小和松緊，并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強度及比生長速率密切相關(guān)。3、工藝控制要點（1）種子質(zhì)量的控制絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25 培養(yǎng) 7 天, 真空干燥并以這種形式保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時它按一定的接種量移種到

8、含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主的種子罐內(nèi) ,26 培養(yǎng) 56h 左右, 菌絲濃度達6%-8%, 菌絲形態(tài)正常, 按 10%-15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級種子罐內(nèi),27培養(yǎng) 24h, 菌絲體積 10%-12%, 形態(tài)正常, 效價在700D/ml左右便可作為發(fā)酵種子。球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有O. 5% -1. 0 %玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子, 然后再移人羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米抱子 (又稱生產(chǎn)米), 親米和生產(chǎn)米均為25 靜置培養(yǎng), 需經(jīng)常觀察生長發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4 天, 大米表面長出明顯小集落時要振搖均勻, 使菌絲在大米表面能均勻生長, 待10天左右形成綠色

9、孢子即可收獲。親米成熟接人生產(chǎn)米后也要經(jīng)過激烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng), 生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米300萬只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5 冰箱內(nèi)。工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 (指收獲后的孢瓶在10天以內(nèi)使用) 接人含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi),28 培養(yǎng) 50-60h當pH 值由6. 0-6. 5 下降至 . 0, 菌絲呈菊花團狀,平均直徑在 100- 130m, 每毫升的球數(shù)為 6萬 -8萬只, 沉降率在 85% 以上, 即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在8000-11000只/ml 范圍的要求, 計算移種體積, 然后接入發(fā)酵罐, 多余的種子液棄去。球狀菌以新鮮孢子為佳, 其

10、生產(chǎn)水平優(yōu)于真空干燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少。（2）培養(yǎng)基成分的控制a. 碳源產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 進行流加。b. 氮源氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補加無機氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。c. 前體生物合成含有芐基基團的青霉素 G, 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于%, 并采用多次加入, 以防止前體對青霉素的毒害。d. 無機鹽加人的無機鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等, 且用量要適度。另外, 由于鐵離子對青霉菌有毒害作用, 必須嚴格控制鐵離子的濃度,

11、 一般控制在30 g/ml 。（3）發(fā)酵培養(yǎng)的控制a. 加糖控制加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過程中的 pH 值確定 , 最好是根據(jù)排氣中CO2 量及 O2 量來控制, 一般在殘?zhí)墙抵?% 左右, pH 值上升時開始加糖。b. 補氮及加前體補氮是指加硫酸銨、氨水或尿素, 使發(fā)酵液氨氮控制在 O. 01%,補前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 % 。-c. pH 值控制對pH 值的要求視不同菌種而異, 一般為 pH 可以補加葡萄糖來控制。目前一般采用加酸或加堿控制pH值。 d. 溫度控制前期 2 5- 2 6 , 后期 23 , 以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。e. 溶解氧的控制一般要求發(fā)酵

12、中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30% 。通風(fēng)比一般為1 : 0.8L/(L min), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。f. 泡沫的控制在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑 泡敵 來消泡, 應(yīng)當控制其用量并要少量多次加入, 尤其在發(fā)酵前期不宜多用, 否則會影響菌體的呼吸代謝g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制生產(chǎn)上按規(guī)定時間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 ,根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度, 通過追加糖或補加前體等各種措施來延長發(fā)酵時間, 以獲得最多青霉素。當菌絲中空泡擴大、增多及延伸, 并出現(xiàn)個別自溶細胞, 這表示菌絲趨向衰老, 青霉素分泌逐漸停止, 菌絲形態(tài)上即將進入自溶期, 在此時期由于茵絲自溶, 游離氨釋放, pH 值上升, 導(dǎo)致青霉素產(chǎn)量下降, 使色素、溶解和膠狀雜質(zhì)增多, 并使發(fā)酵液變蒙古稠, 增加下一步提純時過濾的困難。因此, 生產(chǎn)上根據(jù) 鏡檢 判斷, 在自溶期即將來臨之際, 迅速停止發(fā)酵, 立刻放罐, 將發(fā)酵液迅速送往提煉工段。