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1、微生物快速檢測方法簡介微生物快速檢測方法簡介1常見微生物檢測項目常見微生物檢測項目n常規(guī)微生物項目常規(guī)微生物項目 細菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、霉菌及酵母菌n致病微生物項目致病微生物項目 沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等2n傳統(tǒng)計數(shù)改良法傳統(tǒng)計數(shù)改良法1、培養(yǎng)膜法2、螺旋平板計數(shù)法：螺旋接種儀菌落計數(shù)3、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測n快速檢測的新方法快速檢測的新方法1、ATP生物熒光法2、電阻抗法3、顏色變化4、流式細胞技術(shù)及激光掃描技術(shù)5、其它：熱量法，放射測量法常規(guī)微生物檢測方法常規(guī)微生物檢測方法3培養(yǎng)膜

2、法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)n原理 二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。n操作方法：檢樣稀釋取1ml滴于下膜正中央蓋上膜擴展器壓成20cm2圓圈 37培養(yǎng)24h 計數(shù)(顯色的斑點)4培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)n優(yōu)點：可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基?？晒?jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時間、人力和費用。因為有顯色劑和小方格，計數(shù)方便。節(jié)約稀釋的繁瑣動作?？煽焖贉y試致病菌，節(jié)省大量的實驗步驟。n缺點成本比傳統(tǒng)方法要稍高些。測試細菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時不能節(jié)約培養(yǎng)時間。5培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)n應(yīng)用細菌總數(shù)測試片中含有一種紅色指示染劑，使所有菌落易認別計數(shù)。大

3、腸菌群 測試片中含有指示劑，使菌落為紅色，且有氣泡產(chǎn)生。大腸桿菌指示劑可使所有菌落為紅色，并可留住大腸桿菌產(chǎn)生的氣泡。24小時可確定大腸桿菌數(shù)。6霉菌和酵母菌計數(shù)測試片中加入的抗生素，可以抑制細菌生長；指示劑使酵母菌易認別計數(shù)；霉菌可產(chǎn)生特有的色澤。金黃色葡萄球菌使用了具有熱穩(wěn)定的核酸酶反應(yīng)片，核酸酶反應(yīng)產(chǎn)生的粉紅色環(huán)帶色圍著一個紅色或蘭色菌落即為金黃色葡萄球菌，26小時可確認結(jié)果。培養(yǎng)膜法培養(yǎng)膜法_快速檢測紙片技術(shù)7螺旋平板法螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀自動菌落計數(shù)儀8n原理原理 樣品制備的菌懸液在瓊脂表面形成阿基米德螺旋型軌跡。當用于分液的空心針從平板中心移向邊緣時，菌液體積減 少，注入

4、的體積和瓊脂半徑間存在指數(shù)關(guān)系。培養(yǎng)時菌落 沿注液線生長。用一計數(shù)的方格來校準與瓊脂表面不同區(qū)域有關(guān)的樣品量，計數(shù)每個區(qū)域的已知菌落數(shù)，在計算細菌濃度。螺旋平板法螺旋平板法9平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍阿基米德螺旋型軌跡 螺旋平板法螺旋平板法10n優(yōu)點優(yōu)點與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。n缺點缺點檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻煩。螺旋平板法螺旋平板法11濾膜法濾膜法n濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。n優(yōu)點優(yōu)點靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數(shù)。n缺點缺點 需要額外的支出購

5、買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。12ATPATP生物熒光法生物熒光法n原理原理 ATP螢光素+螢光素酶+O2AMP+Ppi+CO2+氧化螢光素+光n應(yīng)用應(yīng)用用于食品生產(chǎn)線和管道進行快速清潔程度檢測。用于水質(zhì)檢測。改良后用于食品的商業(yè)無菌檢測或終產(chǎn)品檢驗。131010秒獲得結(jié)果秒獲得結(jié)果涂抹采樣涂抹采樣混合混合:震蕩震蕩5s5s檢測檢測表面清潔度表面清潔度/水質(zhì)檢測水質(zhì)檢測ATPATP生物熒光法生物熒光法14nATPATP法檢測成品的優(yōu)缺點法檢測成品的優(yōu)缺點優(yōu)點：大大縮短庫存時間，減少

6、物流壓力和成本。缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，有存在假陰性的可能。ATPATP生物熒光法生物熒光法15電阻抗法測定細菌總數(shù)電阻抗法測定細菌總數(shù)n原理原理供細菌生長的液體培養(yǎng)基是電的良導(dǎo)體，在特制的測量管底部裝入電極插頭，即可對接種生長的培養(yǎng)基的阻抗變化進行檢測。阻抗變化的產(chǎn)生是由于微生物生長過程中的新陳代謝使培養(yǎng)基中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)(糖、脂類、蛋白質(zhì)等）被分解成小分子代謝物，即較小的帶電離子（乳酸鹽、醋酸鹽、重碳酸或氨等）這些代謝產(chǎn)物的出現(xiàn)和聚集，增強了培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能，從而降低了其阻抗值。16M=(RM=(R0 0-R-RT T)/R)/R0

7、0100%100%其中R0表示開始時培養(yǎng)基的阻抗值RT表示任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值M表示培養(yǎng)基電阻減少的百分數(shù)。電阻越小細菌活動越多，在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位的對數(shù)Log(CFU)與IDT（阻抗檢測時間）呈直線關(guān)系。電阻抗法測定細菌總數(shù)電阻抗法測定細菌總數(shù)17n優(yōu)缺點優(yōu)缺點：電阻抗法較省力，樣品細菌數(shù)在418小時內(nèi)出結(jié)果。但對于菌數(shù)太低的不好，樣品中還不能用防腐劑，否則結(jié)果是亂七八糟的。電阻抗法制作標準曲線過程中工作量較大，但以后的檢測簡便的多，不需要一系列稀釋，只需樣品1ml，培養(yǎng)基9ml，測量管一只。電阻抗法測定細菌總數(shù)電阻抗法測定細菌總數(shù)18通過顏色變化檢測n微生物生長導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)

8、生變化，由光學(xué)檢測器檢測底部瓊脂層的顏色變化，記錄達到突變點的時間。n與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。n缺點：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。19梅里埃的梅里埃的BacT/AlertBacT/Alert微生物檢測儀微生物檢測儀基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測反射光的強度。光強度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。20流式細胞技術(shù) n原理原理液體樣品流過儀器中的激光照射的流動池，當微生物流過顯微鏡聚焦的流動池時就能被自動地檢測到。n特點特點檢測方法與使用的儀器有高度的特異性，所以應(yīng)遵循生產(chǎn)廠商提供的方法。21nFO

9、SSFOSS公司公司BactoScan FCBactoScan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀牛奶中總菌數(shù)快速檢測儀采用流式細胞原理。對微生物進行核酸染色，用流式細胞技術(shù)進行計數(shù)。優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時)缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數(shù)。流式細胞技術(shù) 22n美國美國ChemunexChemunex公司微生物快速檢測系統(tǒng)公司微生物快速檢測系統(tǒng)將流式細胞技術(shù)與活細胞熒光探針標記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。其最大的特點是只檢測活

10、細胞數(shù)，速度極快，處理量大。檢測步驟：1、過濾；2、標記，直接對活細胞和酵母進行標記；3、激光掃描。流式細胞技術(shù)流式細胞技術(shù) 23三種型號的差異三種型號的差異24利用細菌生長時產(chǎn)生熱量的原理設(shè)計而成。微生物在生長和代謝的過程中，能產(chǎn)生大量的代謝熱。由于各種微生物的代謝產(chǎn)物熱效應(yīng)不同，因此可顯示出特異性的熱效應(yīng)曲線圖。熱效應(yīng)曲線圖的形成，是由于培養(yǎng)基含有多種成分，微生物則產(chǎn)生多種不同的代謝產(chǎn)物，以此表現(xiàn)出的熱效應(yīng)為多個曲線峰，如為單一營養(yǎng)成分，則只有一個峰出現(xiàn)。在細菌生長的過程中，用微量量熱計測量產(chǎn)熱量等熱數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機處理，繪制成以產(chǎn)熱量對比時間組成的熱曲線圖，以此推斷細菌存在數(shù)量。微量量熱法

11、微量量熱法25發(fā)射測量法發(fā)射測量法利用細菌在代謝碳水化合物時產(chǎn)生CO2的原理，把微量的放射性標記引入葡萄糖或其他糖類分子中。細菌生長時，糖被利用并放出標記的CO2，將生成的放射性標記CO2從培養(yǎng)裝置中導(dǎo)出或用化學(xué)法吸收后，利用專用的放射測量儀來測定放射性CO2。放射量與菌數(shù)成正比。26致病菌快速檢測方法致病菌快速檢測方法n顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。n免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，熒光酶免、免疫磁分離等方法。n分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測法和PCR法為主。n基因芯片27顯色培養(yǎng)基法顯色培養(yǎng)基法n

12、原理在選擇性培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上經(jīng)過改良。利用細菌特有的生理生化反應(yīng)，使培養(yǎng)基中的指示劑產(chǎn)生顏色變化，以將目標菌與其他菌區(qū)別開來28酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)mini-Vidas全自動免疫分析儀n利用熒光分析技術(shù)通過固相吸附器，用已知抗體來捕捉目標生物體，然后以帶熒光的酶聯(lián)抗體再次結(jié)合，經(jīng)充分沖洗，通過激發(fā)光源檢測，即能自動讀出發(fā)光的陽性標本。n優(yōu)點是檢測靈敏度高，速度快，可以在48小時的時間內(nèi)快速鑒定沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。29分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法n基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當成熟的表現(xiàn)。n有普通PCR，熒光PCR，實時熒光PCR（定量PCR）等多種方法。n基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結(jié)果。nPCR方法一般不需增菌太長時間，通過PCR方法對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。30n優(yōu)缺點優(yōu)缺點分子生物學(xué)方法檢測致病菌，特異性較強，技術(shù)較為前沿，特別是相對國標方面來說。假陽性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢。目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過AOAC的認證。分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法31